Name: purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion
Uploaded: 2018-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion at JoVE.com

Finansman kısmen NIH grant R01HL130864 dan tarafından sağlanır.

Bu protokol için özetlenen tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Lincoln Üniversitesi - iletişim kuralı #1435 altında Nebraska tarafından onaylanmıştır.
1. hazırlık
<ol><li>Çözümler ve kültür ortamı hazırlanması<ol>
<li>Tüm kültür medya ve arabellek Malzemeler tablogöre hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aletleri hazırlanması<ol>
<li>Bir su banyosu ayarla (> 10 L) 42 ° C, değişken hız ve şişeler tutan kelepçeleri Peristaltik pompa. Eğri makas ve forseps (şekil 1) hazırlayın.</li>
		<li>Tarih veya bitişik su banyosu, 20 x 20 cm parça (şekil 1) kesme bir emici underpad ile overlaid bir fırın tepsisine (yaklaşık 38 x 26 cm) ile bir köpük yastık (50 mL konik raf) ayarlayın.</li>
		<li>Yakın maskeleme bandı (5-8 cm) bir parça yerleştirin. 20 cm polyester dikiş ipliği Yani kesme ve kullanıma hazır yakın yerleştirin. Plastik bir kateter geri çekilebilir bir iğne ile (7 mm x 19 mm, şekil 1) elde edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Züccaciye Mağazaları hazırlanması<ol>
<li>Kelepçeler kullanılarak, yer ve hareketsiz bir 1 L şişesi 200 mL 1 x PBS çözüm içine gidiş iki 1 mL Pipetler vardır bir tıpa ile içeren su banyosu. Lastik Mantar devridaim sıvı bir kapalı devre izin vermek için çentikli.</li>
		<li>Başka bir kelepçe ile tampon 2 45 mL sıvı sıvı kalır ve balonun oksijen darbeler alt şişeye ve diğer biri iki 1 mL Pipetler, vardır bir tıpa ile birlikte içeren bir 125 mL şişe yerleştirin. Not: Her pipet Stoppers kolay tüp geçiş için sonu iliştirilmiş adaptörü çıkarın hızlı olacaktır. Oksijen yavaşça sıvı içinde dalmış değil tıpa pipet ile her iki şişe içine akan.</li>
		<li>Steril crystallizing tabağı kenara.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hayvan yordamı
<ol><li>PBS ve tampon 2 çözümleri 42 ° c su banyosunda ısınmak ve PBS için en az 20 mL/dak tüp sıvı hatları sıcak tutmak için bir kapalı devre içinde dolaşımda. Aşırı herhangi bir boru içinde kalmak için su banyosu bırakın 42 ° C'ye mümkün olduğunca yakın Erkek sonuna 1 L şişe içeren PBS içine tüp drenaj.</li>
	<li>Bir pamuk topağı üzerinde emici underpad yerleştirin ve yaklaşık 2 mL (polietilen hangi isoflurane buharlaşma hızı azalır glikol içinde 200 kadar yapılmış) % 30 isoflurane transfer pipet kullanarak pamuk topu ekleyin.</li>
	<li>Fareyi kuyruğundan almak, crystallizing yemekleri taşıyıcıya yerleştirin ve fare anestezi nefes için küçük bir yerde olması çanak pamuk üzerine hızla devirmek. Fare nefes oranını gözlemlemek ve fare etkili anestezi altında olduğundan emin olun. Not: Solunum hızı daha yavaş ve daha derin, olmalıdır kuyruk sarkık ve pençeleri yanıt vermeyen çimdik testi altında anestezi; IACUC kurallar ek ayrıntılar için bkz.</li>
	<li>Süre (1-2 dakika sürer) anestezi altında fare oluyor, bir 10 mL şırınga varil pistonu çekerek ve küçük bir pamuk ekleme hazırlamak. Pamuk varil içinde 1-2 mL % 30 isoflurane transfer pipet ile eklemek ve bilinçsiz olmak için fare beklerken varil bir masada aşağı open-end yerleştirin.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde crystallizing çanak, fare sırtını çevirme alıp şırınga varil burnu yerleştirin. İki kez kontrol solunum hızı, ayak çimdik ve sarkık kuyruk. Ayak çimdik ve sarkık kuyruk için herhangi bir yanıt fare değil tam anestezi altında olduğunu gösterir. Şırınga varil bilinçsizlik korumak için burun üzerinde tutun.</li>
	<li>Belgili tanımlık paws sırtüstü pozisyonda uzanmış uzuvları ile fare aracılığıyla yer başparmak tacks. Karın ve göğüs kafesi % 70 isopropanol veya etanol ile ıslak.</li>
	<li>Bir elinde düz Forseps ile karın yakın cilt kaldırın. Diğer elinde makasla kesilmiş çadır cilt ve karın zarını. Belgili tanımlık kesme yatay veya çadır cilt Bankası arasında olmalıdır. Gut erişim kazanmak için tüm cilt ve Periton katmanından kesmek emin olun. Yanal göğüs kafesi kadar karın çevresinde her iki tarafta herhangi bir organ nicking olmadan kesti.</li>
	<li>Cilt kapağı kesim tarafından daha düşük göğüs kafesi kesilmiş. Bağırsak portal ven ortaya çıkarmak için forseps arkasına ile sağa doğru ilerleyin. Not: hayvandan kanama en az olmalıdır; hayvan hala nefes ve derin anestezi altında.</li>
	<li>Kapalı eğri forseps karaciğer ve üstün pancreaticoduodenal ven (şekil 3 ok) arasında portal ven altına yerleştirin.</li>
	<li>Forseps portal ven iken altında açın. İş parçacığı tutun ve portal ven ortalanacak şekilde dikkatlice çekin. Aşağı cinching olmadan portal ven çevresinde bir yukarıdan aşağı düğüm kravat.</li>
	<li>Portal ven altında kıvrımlı pensler yerleştirin ve yavaşça ven (şekil 4A) düzeltmek için fare kuyruğu doğru çekin.</li>
	<li>Diğer elinde sonda ile iğne eğimi yukarı doğru ve alt kısmında forseps (şekil 4B) yakınındaki portal ven paralel yerleştirin.</li>
	<li>Yavaşça ven iğne (şekil 4C) ile delik. İğneyi konik ven Lümen içinde olduğundan emin olun. Yaylı iğne geri çekmek ve eğimi Venöz dallı alandır kadar damar yoluyla polimer kateter itmeye devam edin. Karaciğer içinde bu. Kateter doğru şekilde yerleştirilmiş olması durumunda, kan akışının arka görünür hale gelir. (Şekil 4D).</li>
	<li>Yukarıdan aşağı düğüm sıkın ve stabilize yardımcı olmak için kateter üzerinde aşağı çekin. Hemen 20 mL/dk dan Pompa hızı 4 mL/dk geri çevirmek ve drenaj için başka bir büyük kan damarı kesilmiş. En iyi sonuçlar için aorta abdominalis kesti.</li>
	<li>Erkek kadın sonuna kadar kateter (şekil 5A) boru sonuna yerleştirin. Başında hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun. Kateter da karaciğer içine veya damar dışına itti değil dikkatli olun. Damar dışına geri akış önlemeye yardımcı olur ve doğru konumda (şekil 5B, C) kateter tutmanıza yardımcı olur iş parçacığı yerleşimini temel, değildir.</li>
	<li>Boru underpad üzerine immobilize için maskeleme bandı kullanın. Bir kaç kez karaciğer şişirmek için atık kan damarı sıkmak için düz forseps kullanın tüm kan (şekil 5D) drene emin olmak için. Not: Standart laboratuvar bant işe yaramayabilir; Ancak, maskeleme bandı için ıslak koşullarda bile underpad takılıp kalır.</li>
</ol>3. karaciğer perfüzyon
<ol><li>Karaciğer PBS ile kızarma, Collagenase tip IV yaklaşık 24 mg ölçmek ve tampon 2 45 mL su banyosunda içeren şişeye koyun. Böylece collagenase tam olarak feshedilmiştir sıvı şişeye girdap ve böylece şişeye sıvı içeren bölümünü tamamen suda batık şişeye geri kelepçe içinde yer emin olun.</li>
	<li>PBS ile aktarılmadan olarak karaciğer renk değişikliği gözlemlemek. Çıkış boru 1 L şişesi 125 mL şişe için değiştirin. Karaciğer akmaya hava kabarcıkları izin vermez.</li>
	<li>Perfüzyon arabellek karaciğer ulaştıktan sonra kısa bir süre sıkı atık damar bazı basınç gemi içinde oluşturmak ve bu sıvının bütün karaciğer lobları doldurmak izin vermek için sıkmak. Bu karaciğer (Glisson'ın kapsül) çevreleyen ince bağ dokusu patlama ve perfüzyon veya karaciğer kapiller yatak içinde sıvı yok gibi drenaj çok uzun kesmemeye dikkat edin.</li>
	<li>Tampon 2 collagenase tüm 45 mL akan kadar doku ile karaciğer sıvı ile izin verir. Not: Eğer başarılı olursa, Glisson'ın kapsül ayrılmalıdır parankimi ya da karaciğer dokusu ve karaciğer kendini amorf görüntülenmesi gerekir.</li>
	<li>Diğer crystallizing yemek için tampon 1 yaklaşık 10 mL ekleyin ve yanındaki fareyi getirin.</li>
	<li>Kateter kaldırmak ve pompa devre dışı.</li>
	<li>Düz forseps ve makas ile karaciğer fare kesmek. Collagenase sindirim çok etkili olsaydı, el üstünde fare karaciğer kepçe ve tampon 1 yeri temiz, steril bir kaşık alabilir gerekli olabilir.</li>
</ol>4. Hepatosit arıtma
Not: Hücreleri manipülasyon bir steril doku kültürü Hood kontaminasyon hücreleri tüm sonraki adımlar kültürlü olmak istiyorsak sınırlamak için yapılmaktadır.
<ol><li>Steril tekniği kullanarak, karaciğer Forseps ile kapmak ve karaciğer hücrelerinden hafifçe çalkalanır. Altını üstüne getirin veya geri çekme Glisson'ın kapsül: hücreleri karaciğer sarsılmış gibi arabellek opak olacaktır.</li>
	<li>Hücre çözümü yerleştirilmiş 100 µm filtre ile 50 mL konik dökün.</li>
	<li>Daha fazla tampon 1 karaciğer kalıntıları ekleyin ve hücreleri titremeye devam edin. Karaciğer hücreleri veya ne zaman karaciğer sindirilmemiş bölümlerini artık hücreleri verimi değil yoksun görünene kadar devam edin.</li>
	<li>Hücresel sıvı başka bir 50 mL 40 µm filtre içeren konik dökün.</li>
	<li>Konik bir sallanan kova Open End 100 x g de 3 dk santrifüj kapasitesi. Not: Bu hücre Pelet çıkarmak en fazla fren kullanmayın. Tüm kalan Santrifüjü adımları 4 ° C'de için yeterli olan %80, fren kullanın</li>
	<li>(Hangi içermek NPCs ve ölü tetkikine) süpernatant temiz konik dökün ve buz üzerinde yerleştirin. Bu Pelet bağlılık gözlemlemek için bir hareket yapılır emin olun.</li>
	<li>Pelet tampon 1 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları yineleyin. Pelet tampon 3 40 mL resuspend. 4.5 ve 4,6 adımları iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Arıtılmış tetkikine sıcak DMEM + 10 resuspend % FBS + 2 x penisilin-streptomisin (kalem/Strep).</li>
	<li>Hücreleri kollajen kaplı Tabaklarda kültürlü, 1 h için bağlı kalmak izin ve Değiştir medya en az bir kez bu kadar herhangi bir yeni doğmakta olan bakteriyel kirletici engeller.<ol>
<li>Onları % 0.001 Asetik asit için en az 1 h 37 ° C'de % 0.05 kollajen ile kuluçka ve 1 x PBS ile yıkama tarafından kolajen kaplı levha olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hepatosit canlılığı düşüktür ve arıtılmış yüksek uygun tetkikine elde sonra Kreamer ve ark10' dan adapte aşağıdaki iletişim kuralını kullanmak için bir istek varsa.<ol>
<li>Mix 9 birimleri PVP çözüm (Percoll, % 23 w/w çözüm su ve 15-30 nm kolloidal silika partikülleri polyvinylpyrrolidone yoğunluğu Santrifüjü için kaplı) ve ISO ozmotik PVP çözümünü (SIP) yapmak için 10 x HBSS 1 hacmi.</li>
		<li>Bir steril 50 4 ° C'de 2 aya kadar bu koşullarda depolanan ml konik SIP 24 mL ekleyin</li>
		<li>5-10 × 106 hücre/ml kültür orta adım 4,8 not ettiğiniz biri gibi ile Hepatosit konsantrasyon ayarlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon 25 mL her 24 mL konik içeren SIP ve nazik INVERSION tarafından karıştırın. Bu çözüm 1.06 g/mL yoğunluğudur.</li>
		<li>Konik, 50 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi</li>
		<li>SIP ve flocculant Aspire edin ve HBSS hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Santrifüjü 50 x g 4 ° C'de 10 dakika için de tarafından hücreleri yıkama</li>
		<li>Adımı 4.10.6 bir kez daha yineleyin ve sonra hücre büyüme orta resuspend.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. sn arıtma
<ol><li>Adım 4.6 supernatants hücrelerde tüpler 163 x g 10 dk. atmak için de iplik tüpler üzerinden supernatants cips ve tüm hücre pellet RPMI 5 ml serum olmadan resuspend ve onları birlikte bir tüpte Havuzu.</li>
	<li>Bir kez tüm pellets havuzlu, RPMI 35 mL son hacim için ekleyin.</li>
	<li>Havuza alınan santrifüj kapasitesi 25 x g, konik bir temiz 50 ml konik buzda NPCs içeren bu medya RPMI en iyi 25 mL 25 mL pipet ve yer ile 3 dk. dikkatle Aspire için.</li>
	<li>Taze RPMI 25 mL tüp geri ekleyin ve Pelet resuspend.</li>
	<li>5.3 ikinci yıkama ve havuzu süpernatant için adımları yineleyin. Kalan 10 mL medya ve Pelet (çoğunlukla ölü tetkikine Pelet oluşur) atmak. Havuza alınan süpernatant vasıl 163 x g 10 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Santrifüjü sırasında PVP çözüm degradeler 50 ml konik hazırlayın.</li>
	<li>15 mL % 50 PVP çözeltisi 50 ml konik Percoll fırlatma hızını yavaşlatmak için ayarla bir pipettor ile overlaid % 25 20 mL ardından ekleyin. Bu saniye sürdü ve KCs Santrifüjü sonra nerede toplamak olduğu gibi iki kat demarcates 15 mL işareti bir kırılma satırında gözlemlemek emin olun.</li>
	<li>Soğuk RPMI adım 5.5 10 mL içinde daha önce pelleted hücreleri resuspend ve onları PVP çözüm degrade yerleşimi. İki kat arasında net bir sınır korumak emin olun. Degrade vasıl 805 x g 20 dk santrifüj kapasitesi % 50 ayarlamak bir fren.</li>
	<li>Tüp 20 mL işaretine yukarıdan aşağıya doğru yönde Aspire edin ve bu malzeme atın. 5 mL transfer pipet ile saniye sürdü ve %25/50 arayüzü bulunmaktadır KCs toplamak. Bu ölü tetkikine olarak hücreleri herhangi bir kahverengi kümeleri atmak.</li>
	<li>Hücreleri bir 50 mL konik yerleştirin ve RPMI PVP çözüm sulandırmak için 50 mL işareti kadar ekleyin. 200 x g 10 dk için de % 80 fren ile santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Aspire edin ve süpernatant atın ve sıcak RPMI 12 ml konik koni kapalı yıkarken Pelet resuspend.</li>
	<li>Saniye KCs süpernatant bir polistiren Petri kabına koyarak ayırın ve oksijen doku kültürü kuluçka oda sıcaklığında 8 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Medya bir 25 mL pipet ve durulama KCs süre kalan saniye toplamak için en düşük hızda ayarla pipettor ile aynı medya ile plaka uygun plaka ile Aspire edin.</li>
	<li>Saniye 200 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi ve resuspend RPMI + % 5 içinde FBS + kalem/Strep. O zaman titresi hücreleri ve kolajen kaplı kültür yemekleri yerde.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J Cell Biol. 43 (3), 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Edstrom, S., Ekman, L., Ternell, M., Lundholm, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+liver+cells:+perfusion+technique+and+metabolic+evaluation.">Isolation of mouse liver cells: perfusion technique and metabolic evaluation.</a> Eur Surg Res. 15 (2), 97-102 (1983).</li><li>Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Isolation+and+Purification+of+Murine+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells:+A+Systematic+Review.">Methods for Isolation and Purification of Murine Liver Sinusoidal Endothelial Cells: A Systematic Review.</a> PLoS One. 11 (3), 0151945 (2016).</li><li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+perfusion+of+liver+and+other+organs+for+the+study+of+microsomal+electron-transport+and+cytochrome+P-450+systems.">The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems.</a> Methods Enzymol. 52, 48-59 (1978).</li><li>Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+preparation+of+mouse+liver+Kupffer+cells+and+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells.</a> Munin open research archive. , 1-10 (2012).</li><li>Smedsrod, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+characterization+of+cultures+of+Kupffer+cells+and+liver+endothelial+cells+prepared+by+means+of+density+separation+in+Percoll,+and+selective+substrate+adherence.">Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence.</a> Cell Tissue Res. 241 (3), 639-649 (1985).</li><li>Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+method+for+mouse+liver+sinusoidal+endothelial+cell+isolation.">An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation.</a> Exp Cell Res. 349 (2), 291-301 (2016).</li><li>Kreamer, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+low-speed,+iso-density+percoll+centrifugation+method+to+increase+the+viability+of+isolated+rat+hepatocyte+preparations.">Use of a low-speed, iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (4), 201-211 (1986).</li><li>Meijer, D. K., Keulemans, K., Mulder, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+perfused+rat+liver+technique.">Isolated perfused rat liver technique.</a> Methods Enzymol. 77, 81-94 (1981).</li><li>Gopalakrishnan, S., Harris, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liver+endocytosis+followed+by+purification+of+liver+cells+by+liver+perfusion.">In vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion.</a> J Vis Exp. (57), e3138 (2011).</li><li>Cook, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Anatomy of the Laboratory Mouse. , (1965).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Method+for+Isolation+of+Mouse+Hepatocytes+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells,+and+Kupffer+Cells.">Advanced Method for Isolation of Mouse Hepatocytes Liver Sinusoidal Endothelial Cells, and Kupffer Cells.</a> Methods Mol Biol. 1540, 249-258 (2017).</li><li>Knobeloch, D. E., Ehnert, S., Schyschka, L., Buchler, P., Schoenberg, M., Kleeff, J., Thasler, W. E., Nussler, N. C., Godoy, P., Hengstler, J., Nussler, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Hepatocytes:+Isolation,+Culture,+and+Quality+Procedures.">Human Hepatocytes: Isolation, Culture, and Quality Procedures.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 99-120 (2012).</li><li>Clarke, B. L., Weigel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recycling+of+the+asialoglycoprotein+receptor+in+isolated+rat+hepatocytes.+ATP+depletion+blocks+receptor+recycling+but+not+a+single+round+of+endocytosis.">Recycling of the asialoglycoprotein receptor in isolated rat hepatocytes. ATP depletion blocks receptor recycling but not a single round of endocytosis.</a> J Biol Chem. 260 (1), 128-133 (1985).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol kullanılabilir durumdadır ve bu başarı bu yordamdaki yüksek orandaki kullanıcı gerçekleştirecek araçları vurgulayan daha basit. Başarılı bir perfüzyon Primer hücre ile çalışırken herhangi bir aşağı akım uygulama için temel olabilir.
Başarısını belirlemek birkaç kritik adım yordam vardır. İlk olarak, portal ven içinde kateter ucu yerleşimini doğru olması gerekir. Eğer çok ileri karaciğer içinde yerleştirilmişse periosteum sadece küçük loblar. Ucu sadece sağ ve sol dallarında portal ven olmalıdır. Bir iğne üzerinde bir polimer kompozit kateter kullanmanın avantajı iğne barb daha bir kateter daha perfüzyon sırasında damar gözyaşı olasılığı olmasıdır. İkinci olarak, collagenase kalite ve miktar karaciğer sindirim verimliliğini belirlemek. Bu yordamda, önceden nitelikli collagenase tip 4 kullanıldı ve denetlesinler için collagenase etkinliği 900 IU büyük ise 0,5 mg/mL tampon 2, resuspended.
Collagenase perfüzyon sonunda, karaciğer kahverengi renk için biraz karanlık bir tan bulundurmalısınız. Açık kahverengi renk ise, hepatositlerin çoğu ölü. Karaciğer otelde fare kesmek ayrı düşen. En iyi koşullarda, karaciğer küçük bir kaşık ile fare vücut boşluğuna dışarı scooped. Bu durumda karaciğerleri her zaman çok yüksek hücre canlılık verir. Karaciğer ayıklama sırasında hala sağlam ise hücreler ayrı, sallamak için çok çaba alır veya kuvvet tetkikine filtreler aracılığıyla taşımak için gerekli bir sürü ise, hepatositlerin daha düşük bir canlılık olacaktır. Hepatositlerin onları çok yüksek yüzey alanı (şekil 10) olmasını sağlayan microvilli ile kaplıdır. Hücre-hücre kavşak tetkikine arasında eksik sindirim korur ve mekanik kesme Plazma zarı parçalara ayıracak. Situ perfüzyon collagenase ile hücreleri parçalayın ve yüksek canlılık korumak için en iyi yöntemdir. Şekil 11' de, iki Hepatosit hazırlıkları hangi hücrenin granül yapılır karşılaştırıldığında birkaç yıkar sonra tampon 1. Sol Pelet hafiftir ve yaklaşık % 50 bir hücre canlılığı içerir. Sağdaki Pelet koyu olup, bir canlılık % 92. Sıvı 50 mL konik dökülür, benzer şekilde, daha koyu Pelet sıvı kapalı dökülür gibi hangi tüp Slayt hafif Pelet aksine tüp içinde sabit olur. Karaciğer skleroz yüksek düzeyi vardır alt hücre canlılığı veya verimsiz perfusions ortaya çıkabilir.
Canlı tetkikine ölü tetkikine daha yüksek yoğunluklu beri Santrifüjü yordamlar uygun tetkikine15dakika içinde son derece saf bir hazırlık neden olur. Eğer (koşullar suboptimal olduğunda hangi sıklıkta oluşur) ölü tetkikine, önemli miktarda canlı hücreler daha olması zenginleştirilmiş ve ölü hücreleri PVP degradeler kullanarak ayrılmış. Ayrıca, canlı tetkikine ölü tetkikine daha hızlı cips beri Pelet en iyi 3rd aspirasyon Pelet ölü hücreleri canlı oranı da artacaktır. Bu işlemleri hızlı ve kolay yöntemler ayırmak için ölü tetkikine yaşamak ve hücre gerektiğinde enkaz10,16. Örnek değerli ve bir kaç milyon hücre deney için gerekli olan sadece bu özellikle yararlıdır.
Sonuç olarak, hepatositlerin ve saniye karaciğer hasat için kolay ve etkin bir yöntem bu. Cari fiyatlarla tüm reaktifler ve tek kullanımlık dahil olmak üzere bu yordamı gerçekleştirme hazırlık küçük 75 YTL maliyetidir. Birden çok fareler istenirse, Hepatosit arıtma ile devam etmek ve tüm fareler işlenene kadar NPC kesir buz üzerinde tutmak en iyisidir. NPCs buz en az 5 h için genellikle sabit, ama daha uzun zaman bu laboratuvarda sınanmamıştır.

Collagenase perfüzyon tetkikine elde etmek için karaciğer erken 1950'lerden beri gerçekleştirilen ve sürekli1,2,3,4geliştirilmiştir. Çok güzel bir inceleme yöntemleri, teknikleri ve karaciğer hücre Arıtma kullanılan reaktifler çoğunun Meyer ve ark5' te derlenmiştir. Son derece uygun tetkikine ve saniye bir tatmin edici verim alma teknik olarak zordur. Collagenase kalitesini de dahil olmak üzere hücreleri ayrı mekanik kuvvetleri kontrol etmek zor değişkenleri bazılarıdır. Mekanik Kuvvetleri Hepatosit duyarlılık nedeniyle, canlılığı belirgin yalıtım için en uygun koşulları açıklayan bir protokol ihtiyacını isteyen alt-optimal koşullarda azalır. Saniye mekanik kesme için hassas olmak görünür. Situ perfüzyon ile collagenase sindirim karaciğer ve diğer organlara bağırsak ve dalak6gibi tek hücre ürünleri almak için hücre-hücre kavşak bozmak için en iyi yöntem gereğidir. Bu iletişim kuralı perfüzyon arabellek portal ven daraltmak, portal ven Smedsrød ve ark7' de açıklandığı gibi neden olabilir bir kesi yerine bir geri çekilebilir plastik kateter kullanarak tanıtmak için basit bir yöntem gösterir.
Bu el yazması karaciğer bolluk yordamı başarı için gereken en kritik adımları göstermek için hedeftir. Kateter yerleştirme, bu adımlar içerir perfüzyon sıvılar ve sindirim sonra doku işleme akışı. Akış oranları kan akımı doğal hızı üzerinde ayarlanmış ama Glisson'ın kapsül sağlam tutmak için yeterince düşük. Bir kez karaciğer düzgün sindirmek ve hücreler çözümde ayrılır, hücre arıtma olup olmadığını fark Santrifüjü, plaka yapışma, veya manyetik boncuk arıtma tarafından gerçekleştirilen oldukça kolaydır. Canlı tetkikine yüksek yoğunluklu var ve nonparenchymal hücreleri (NPCs) ve yavaş hız Santrifüjü ile ölü tetkikine kolayca saf. Çoğu uygulama için Kupffer ayırmak için plaka adezyon (KCs) hücreleri ve saniye olduğu ortak bir yöntem8saniye9en iyi saflığı üretmek değildir raporları olsa. KCs katı sert yüzeylere hızlı bir şekilde bağlı kalmak için bir eğilimi var ve Petri yemekler (Standart polistiren) bu yordamı için en sık kullanılan malzeme vardır. SN veya KC saflaştırılması kullanımıyla manyetik boncuklar antikor Birleşik hiç şüphesiz en iyi bu hücrelerinin önemli arıtma rağmen bu protokolü üzerine başka bir 3-4 h yordamı ekler ve genel verim azalmıştır9yöntemdir. Bu rapor için genellikle hücrelerin sayısının yüksek verimleri en uygun bir karaciğer perfüzyon sürecini ayrıntılı olarak gösterir.

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1 L Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>This tubing runs from the flasks through the pump to the T connector and then to the 1.0 mL syringe that is connected to the catheter.</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>R3603</td><td>Used as an adaptor between 96400-14 and pipettes and T connector.&amp;nbsp; This may also be used for the oxygen tubing.</td></tr><tr><td>T-connectors</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06294-82</td><td></td></tr><tr><td>Quick dissconnects</td><td>Fisher Scientific</td><td>6150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Pinch Clamps</td><td>Fisher Scientific</td><td>6165-0002</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Variable speed Pump, model 7553-70</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07559-00</td><td>Periplastic pump with variable speed</td></tr><tr><td>Pump head, model 7014-20</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07014-20</td><td></td></tr><tr><td>glass graduated 1.0 mL pipettes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678</td><td></td></tr><tr><td>curved non-serrated scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14069-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-377-23</td><td>Only barrel of syringe will be needed</td></tr><tr><td>sterlized spoon</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton ball(s)</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyester sewing thread</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masking tape</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>thumb tacks</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>styrofoam pad&amp;nbsp;</td><td>50 mL conical rack</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cookie/baking sheet</td><td>Home supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorbant underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-64</td><td></td></tr><tr><td>19 L water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSCOL19</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autogaurd Shielded IV Catheter 24 guage</td><td>Becton Dickinson</td><td>381412</td><td>Plastic cathetar with retractable needle</td></tr><tr><td>Crystallizing dishes 100x50</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>89000-290</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene petri dishes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipettes (5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>170355</td><td></td></tr><tr><td>graduated pipettes (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>170357</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer 100 &amp;mu;M</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>100 &amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>EasyStrainer 40 &amp;mu;M</td><td>Greiner bio-one</td><td>542040</td><td>40&amp;mu;m filter</td></tr><tr><td>Sterile transfer pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated swinging bucket centrifuge</td><td>Sorvall Legend XTR</td><td>75-217-406</td><td>Centrifuge with swinging bucket rotar</td></tr><tr><td>Galaxy 170R tissue culture incubator&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO170R-120-0000</td><td>Humidified tissue culture incubator</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Compound&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Grams (g/L)&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Millimolar (mM)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Buffer 1, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8.3</td><td>142</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.5</td><td>6.7</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>2.4</td><td>10</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td>Buffer 2, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>3.9</td><td>66.74</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.5</td><td>6.71</td></tr><tr><td></td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>0.7</td><td>6.31</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>24</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td></td><td>Phenol Red</td><td>0.01</td><td>0.03</td></tr><tr><td>Buffer 3, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8</td><td>137</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.35</td><td>4.7</td></tr><tr><td></td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>0.08</td><td>0.66</td></tr><tr><td></td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>0.18</td><td>1.62</td></tr><tr><td></td><td>HEPES</td><td>2.4</td><td>10</td></tr><tr><td></td><td>BSA</td><td>15</td><td>0.226</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>NaCl</td><td>8</td><td>137</td></tr><tr><td></td><td>KCl</td><td>0.2</td><td>2.7</td></tr><tr><td></td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>1.15</td><td>4.3</td></tr><tr><td></td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>0.2</td><td>1.4</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Percoll (PVP solution)</td><td>GE Healthcare</td><td>288555</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab144581</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hepatocyte Growth Medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Long-term Hepatocyte Growth Medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Glucagon&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G3157-2mg</td><td>14 ng/mL</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td>0.5 U/mL</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma</td><td>H0888-1g</td><td>7.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>BD Biosciences</td><td>354001-100ug</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LSEC medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% by volume fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437010</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep (2x)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion

Bu iletişim kuralı yüksek verim ve canlılığı fare tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri (saniye) kültür veya hücre lysates elde etmek için uygun elde etmek için bir yöntem gösterir. Bu kirlenme son karaciğer hazırlık diğer olası hücre tiplerinin sınırları olarak bu protokol için portal ven site Kateterizasyon için vena kava yerine kullanılır. Hiçbir özel araçları yordam gereklidir. Bir su banyosu ısı kaynağı olarak tüm arabellekleri ve çözümleri sıcaklığını korumak için kullanılır. Standart Peristaltik pompa sıvının sürücü için kullanılır ve buzdolabında bir masa üstü santrifüj Santrifüjü yordamlar için gereklidir. Sadece bu tekniğin bazı 18-25 g boyut aralığı fareler zorlu portal ven içinde kateter yerleştirme kısıtlamasıdır. Bir avantajdır bu tekniğin tek bir ven perfüzyon için kullanılmaktadır ve damar erişim hangi iskemi ve reperfüzyon karaciğer hücre canlılığı azaltır karaciğer en aza indirir, hızlıdır. Bu iletişim kuralı için bir diğer avantajı canlı ölü tetkikine hücresel yoğunluk farklılığı nedeniyle görme tarafından Santrifüjü adımları sırasında ayırt etmek kolay olmasıdır. Bu iletişim kuralı hücrelerden hücre kültüründe herhangi bir aşağı akım uygulama için kullanılacak yanı sıra herhangi bir biyokimyasal değerlendirme için işlenmiş.

Karaciğer perfüzyon ve arıtma/zenginleştirme tetkikine ve saniye bir gösteri ve rafine bir yöntem burada ayrıntılı ipuçları için optimum hücre arıtma/zenginleştirme başvurulan bunda derlenmiş diğer basılı raporlara benzer sağlayan sunulur 5gözden geçirin. Başarı için hücresel arıtma belirleyen önemli adımlar rota ve teknik ayrıntıları collagenase perfüzyon yordam bulunur ve bu protokol için özetlenen. Kurulum aparatı için oldukça basit ve düşük maliyetli standart Laboratuar donanımları, yayımlanmış11 (şekil 1) olmuştur diğer sistemlerin aksine ile. Bu kurulum, fare tutan tepsi su banyosu bazı karaciğer içinde Ventriküler sıvı sıcaklığını korumak için su banyosu içinde aşırı boru ile oturuyor. Burada gösterildiği gibi cihazlar sıçan karaciğer perfüzyon12 (Şekil 2) için biraz farklı bir geometri ile fareler, yanı sıra fareler için kullanılabilir.
Bu yordam, karaciğer portal ven yerine (Bu başka bir popüler perfüzyon rota) vena kava yoluyla karın içinde erişim kolaylığı nedeniyle derin ve damar doğrudan karaciğer beslemeleri. Görüntüleyiciyi portal ven perfusate kısa devre birkaç küçük dalı vardır ve bu dallar en iyi başarı13 (şekil 3) geçmiş kateter yerleştirilmesi gerektiğini bilmeniz gerekir. Portal ven tanımlanır sonra karaciğer ve üstün duodenal pankreas ven arasında bir cerrahi dikiş veya portal ven altında polyester iplik çizmek için eğri forseps kullanılmaz. Forseps pozitif kan basıncı (şekil 4A) altında olan portal ven dışarı düzeltmek için de kullanılır. İğneyi kateter içinde paralel ve damar (şekil 4B) yanında yer almalıdır ve eğimi yavaşça ven (şekil 4C) Lümen eklenmesi gereken. Uygun yerleştirme kateter görünen kan ile belirtilir. İğne geri çektiği bir kez kateter onu bağladı bir iplik ile stabilize ve kan basıncı kan kadar ile kateter zorlar. Bu kan (şekil 4D) dökülmelere önce kateter pompa boru bağlı olması tavsiye edilir. Pompa boru bağlantı kurulduktan sonra hemen vena kava veya aorta abdominalis kan/sıvı drenaj (şekil 5A) gibi büyük bir kan damarı kesilmiş. Karın kan birikmesi perfüzyon işleminin görselleştirmek zorlaştırır ve kan hücre arıtma (şekil 5 taşımak gibi fare için yeterli drenaj, karın duvarı tarafına kesmek genellikle gereklidir B). karaciğer sıvı PBS başladıktan sonra karaciğer kan (şekil 5C) yokluğu ile beyazlatmak. Eğer sadece birkaç LOB beyazlatmak, olası neden kateter yerleştirilen çok ileri karaciğer içinde ve yavaş yavaş yedeklenmesi gerekir olmasıdır. Kateter yerleştirme onayladıktan sonra suya dayanıklı maskeleme bandı yerde boru güvenliğini sağlamak için kullanın. Genel laboratuvar bant genellikle yeterli değildir. Kateterin uygun yerleştirme onaylamak için kesme damar drenaj ateşkes ve karaciğer içindeki artış basıncı gözlemlemek için sıkmak. Bunu kan karaciğer (şekil 5D) dışarı fışkırma yardımcı. Collagenase çözüm Başlangıçta tüm LOB collagenase için maruz kalır emin olmak için karaciğer içine girdiğinde Ayrıca yapılması gerekir. Collagenase sonra çözüm biterse, iyi collagenase sindirim tarafından parankimi Glisson'ın kapsül, ayrılık göstergesidir.
Genel yordam hücresel arıtma için şekil 6 ' da belirtilen ve hangi tetkikine erken bölümündeki yordamı sırasında düşük hızlı hasat Şekil 7 döner ve 4 BSA içeren arabellekleri (şekil 8 yıkar sonra çok saf ). Saniye KCs ile ortak bir PVP degrade (Şekil 9A) saflaştırılmış ve kolajen kaplı polistiren Petri kabına tarih seçici yapışma tarafından ayrılmış. Bu yöntemi kullanarak saniye saflık 83-%90 saf ve collagenase sindirim (Şekil 9B) genel etkinliğini büyük ölçüde bağlıdır. Işık kullanarak nicel ölçüleri mikroskobu (hepatositler ve saniye ayırt edici özellikleri diğer hücrelerden gibi) göstermek bu temsili bir hazırlık olarak, hepatositlerin neredeyse % 100 saf ve saniye vardır biraz üzerinde % 89 saf (Tablo 1). Alternatif olarak, her ne kadar bu iletişim kuralı kapsamý dýþýndadýr saniye daha yüksek bir zenginlik manyetik sütun ayrılıktan sonra PVP degrade tarafından alınabilir. Meyer ve ark. saniye ve KCs manyetik ayırma hakkında daha fazla bilgi bulunabilir 9 ve Liu vd. 14 bu canlılığı hepatositler hızla yeterince sindirilmiş bir karaciğerde azalır, ancak bu gerekli true için NPCs. yeterince sindirilir karaciğerleri aynı zamanda tamamen değil daha hücresel enkaz üretmek değil unutulmamalıdır Santrifüjü adımda ortadan kaldırılmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig1.jpg"> Resim 1 : Perfüzyon paketinin şematik gösterim. Şişeler (gösterilmez); kelepçeler tarafından yerinde tutulur içeren sıvı 1 L şişesi 125 mL şişe için işlem sırasında takas edilir tüp kırmızı noktalı çizgiyle temsil edilir. Dikkat, oksijen besleme şişe çözümlerinde içine doğrudan kabarcık değil. Mantarlar da kapalı devre sıvı akış içinde çentik eklenen boru ile izin vermek için çentikli. Boru ve tüp içinde tüm hava dışarı atmak için Isınma sırasında bu önemlidir. Hava taşma payı Tygon boru ve hızlı açık için çimdik kelepçeler ve sistem kapatılması bağlı T Bağlayıcısı oluşur. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig2.jpg"> Resim 2 : Fare karaciğer perfüzyon sırasında perfüzyon Süiti. Tepsiyi fare ile su banyosu köşesine yerleştirilir. Bu zaten ısınma sırasında oksijenli gibi oksijen collagenase eriyik--dan kesilir. Öğenin yerini çoğu A) oksijen çizgiler, PBS, collagenase, D) pompa, pompa E) denetimleri, F) kabarcık tuzak, G) sıvı hattı pompa ve fare balonun çalışan ile tampon 2 içeren C) 125 mL şişe içeren B) 1 L cep şişesi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig3.jpg"> Şekil 3 : Fare karın damarlara görüntüsünü. Kateterin ekleme sadece portal ven (yeşil nokta) geliyor mide ve pankreas ven kavşak aşağıda olmalı ve ucu sol ve sağ hepatik portal bir çatal karaciğer lobları ana oluşturan damarları (sarı nokta) yakınında yer almalıdır. Bir kez doğru yerleşim elde, kateter basit bir yukarıdan aşağı düğüm kullanarak iş parçacığıyla stabilize. K böbrek, L = karaciğer, SI = ince bağırsak =. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig4.jpg"> Şekil 4 : Kateter yerleştirme portal ven. (A)forseps kan şişkinliği portal ven, emin olmak için ve damar kateter yerleştirme için dışarı düzeltmek için kullanılır. (B) kateter eğimi ile portal ven paralel olarak dizilmiş. (C) kateter içinde iğne eğimi damar, damar yoluyla eklenir. (D) iğne kateterin geri çekildi ve kan olacak geri tepme kateter aracılığıyla forseps İpucu tarafından belirtildiği gibi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig5.jpg"> Şekil 5 : Uygun karaciğer perfüzyon. (Kateter yerleştirme, kateter kadın radarı sonu (1 mL şırıngadan kesim) erkek radarı sonuna pompa boru hattır sonraA). (Fare yan makas ile dilimleme tarafından karından kesim bir büyük azalan kan damarları, kan ve PBS süzülmüş sonraB). (C) karaciğer kan sifonu çektim ve kabarma Forseps ile sıkma kapalı kesme kan damarı olacaktır zaman baskı altında (D) Haşlamak. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig6.jpg"> Şekil 6 : Hepatosit arıtma ve NPC yalıtım şematik anahat. Santrifüjü adımları çoğunu canlı ve ölü tetkikine parenkima olmayan hücrelerden kaldırma hedefliyoruz. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig7.jpg"> Şekil 7 : Sn zenginleştirme ve arıtma şematik anahat. NPCs tarafından sn ayrılık kısa yapışma tarafından standart polistiren tabakta takip PVP degrade ayrılır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig8.jpg"> Şekil 8 : Hepatositlerin arıtılmış. Hepatositlerin kaplı kollajen doku kültürü Tabaklarda kaplama DMEM + %8 FBS + kalem/Strep ile ve 6 h resim koleksiyonu tarafından takip için mikroskop 400 X tarafından inkübe edildi. Bar eşittir 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig9.jpg"> Şekil 9 : Sn arıtma. (A)saniye sürdü ve KCs %25/50 PVP arabiriminden (sarı ok) toplanmıştır ve serum-Alerjik orta ile yıkanır. (B) saniye standart Petri yemekler tarih seçici yapışma KCs ayrılmış, yıkanmış ve kolajen kaplı doku kültürü yemekleri RPMI + % 5 kaplama FBS. Görüntüleri bir ters EVOS mikroskobu 400 X tarafından alındı. Bar eşittir 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig10.jpg"> Şekil 10 : Fare karaciğer anatomi elektron mikroskobu tarama. Bir fare karaciğer periosteum ile 1 mL/dk'ya 4 dk. hızında sabitleştirici (100 mM sodyum cacodylate, 12 mL % 25 oxazolidin, 15.6 mL % 16 paraformaldehyde, 2.65 mM Kalsiyum klorür, 180.2 mM sukroz, 100 mL solüsyon içinde karışık) tarafından izlenen PBS doku dilimlenmiş ve elektron mikroskobu tarama için hazır. Görüntüleri 10'da, bir alan emisyon SEM toplanan 000 X. Sarı oklar tetkikine arasında microvilli gösterir. Bar eşittir 5 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56993/56993fig11.jpg"> Şekil 11 : Ölü canlı tetkikine karşı görselleştirme. Tampon 1 ile 2 yıkar sonra pelleted tetkikine canlı/ölü oranı için göz tarafından değerlendirildi. Daha hafif bir Pelet (solda) en az yarım tetkikine ölü olduğunu gösterir. Sağdaki daha koyu Pelet daha sıkıca tüp altına pelleted ve daha--dan %90 canlı. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56993/56993fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tablo 1: Hücre arıtma</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hücre tipi</td>
			<td>% hedef hücreleri</td>
			<td>% diğer hücreleri</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hepatosit</td>
			<td>99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sinsusoidal endotel hücreleri</td>
			<td>89.1</td>
			<td>10,9</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Hücre saflık ışık mikroskobu tarafından değerlendirilmesi.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion at JoVE.com

Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

This protocol demonstrates a method for obtaining high yield and viability for mouse hepatocytes and sinusoidal endothelial cells (SECs) suitable for ...

purification-hepatocytes-sinusoidal-endothelial-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

50.1K Görüntüleme.  University of Nebraska. Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Video: Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in cell-to-cell communication by shuttling bioactive molecules such as RNA or protein from one cell to another. Most studies of EVs have been performed in cell culture models or in EVs isolated from body fluids. There is emerging interest in the isolation of EVs from tissues to study their contribution to physiological processes and how they are altered in disease. The isolation of EVs with sufficient yield from tissues is technically challenging because of the need for tissue dissociation without cellular damage. This method describes a procedure for the isolation of EVs from mouse liver tissue. The method involves a two-step process starting with in situ collagenase digestion followed by differential ultra-centrifugation. Tissue perfusion using collagenase provides an advantage over mechanical cutting or homogenization of liver tissue due to its increased yield of obtained EVs. The use of this two-step process to isolate EVs from the liver will be useful for the study of tissue EVs.

This is a protocol to isolate tissue extracellular vesicles (EVs) from the liver. The protocol describes a two-step process involving collagenase perfusion followed by differential ultracentrifugation to isolate liver tissue EVs.

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Biyokimya

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Biyoloji

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 as ribonucleoproteins (RNPs) and mRNA. Primary mouse hepatocytes were isolated using a three-step retrograde perfusion method resulting in high yields of up to 50 &#215; 106 cells per liver and cell viability of &#62;85%. This protocol provides detailed instructions for plating, staining, and culturing hepatocytes. The results indicate that electroporation provides a high transfection efficiency of 89%, as measured by the percentage of green fluorescent protein (GFP)-positive cells and modest cell viability of &#62;35% in mouse hepatocytes.
To demonstrate the utility of this approach, CRISPR-Cas9 targeting the hydroxyphenylpyruvate dioxygenase gene was electroporated into primary mouse hepatocytes as proof-of-principle gene editing to disrupt a therapeutic gene related to an inherited metabolic disease (IMD) of the liver. A higher on-target edit of 78% was observed for RNPs compared to 47% editing efficiency with mRNA. The functionality of hepatocytes was evaluated in vitro using an albumin assay that indicated that delivering CRISPR-Cas9 as RNPs and mRNA results in comparable cell viability in primary mouse hepatocytes. A promising application for this protocol is the generation of mouse models for human genetic diseases affecting the liver.

This protocol describes techniques for isolating primary mouse hepatocytes from the liver and electroporating CRISPR-Cas9 as ribonucleoproteins and mRNA to disrupt a therapeutic target gene associated with an inherited metabolic disease of the liver. The methods described result in high viability and high levels of gene modification after electroporation.

Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Biyomühendislik

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Tıp

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on different needs, like time, labor, cost, and primary hepatocyte usage, resulting in various primary hepatocyte isolation protocols. However, the numerous steps and time-consuming reagent preparations in primary hepatocyte isolation are major drawbacks for efficiency. After comparing different protocols for their pros and cons, the advantages of each were combined, and a rapid and efficient primary hepatocyte isolation protocol was formulated. Within only ~35 min, this protocol could yield as much, if not more, healthy primary hepatocytes as other protocols. Further, glucose metabolism experiments performed using the isolated primary hepatocytes validated the usefulness of this protocol in in vitro liver metabolism studies. We also extensively reviewed and analyzed the significance and purpose of each step in this study so that future researchers can further optimize this protocol based on needs.

Primary hepatocytes are a valuable tool to study liver response and metabolism in vitro. Utilizing commercially available reagents, an improved time- and labor-efficient protocol for mouse primary hepatocyte isolation was developed.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Rat Liver Perfusion and Primary Hepatocytes Isolation: An Old Procedure Crucial for Cutting-Edge 3D Organoids Culture

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due to the rapid loss of morphology, viability, and functionality in culture. A recent approach to long-term culture is the generation of three-dimensional (3D) organoids, an in vitro tool that can recapitulate tissues in a dish based on the marvelous ability of the liver to regenerate itself. Published protocols have been designed to obtain long-term functional 3D organoids from primary adult hepatocytes (Hep-Orgs). The 3D organoid cutting-edge tool requires the ability to isolate cells from adult tissue, and this initial step is crucial for a high-quality final result. The two-step collagenase perfusion, introduced in the 1970s, is still a valid procedure to obtain single hepatocytes. The present article aims to describe all the crucial steps of the surgical procedure, thereby optimizing the primary hepatocytes isolation procedure in the rat model. Moreover, particular attention is paid to the PREPARE guidelines to increase the likelihood of successful procedures and ensure high-quality results. A detailed protocol allows researchers to speed up and optimize the downstream work to establish 3D organoids from primary adult rat hepatocytes. Compared to 2D hepatocytes, Hep-Orgs were still viable and in active proliferation at Day 15, demonstrating a long-term potential.

This protocol presents an optimized two-step collagenase liver perfusion technique in a rat model and shows the use of isolated hepatocytes for in vitro long-term culture of 3D organoids.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Primary hepatocytes are a commonly used tool for in vitro liver-related studies. However, the maintenance of these cells has always been a challenge due ...

Isolation and Culture of Mouse Kupffer Cells

Source: Bourgognon, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52989">Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation of Kupffer cells or liver macrophages from the mouse liver. The liver is perfused with a digestion solution followed by density gradient separation. The isolated adherent Kupffer cells can be used for further analysis.

Fare Kupffer Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Source: Bourgognon, M., et al. Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the isolation ...