الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

1-الوظائف-1E الخلايا: صيانة وطلاء
<ol><li>الحفاظ على وظائف-1E الخلايا في هوميديفيد 37 ˚C/5% CO2 حاضنة ومثقف مع المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 5% (v/v) إبطال الحرارة الجنين البقري المصل، مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين الحل, 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول. ثقافة الخلايا في المتوسط RPMI 1640 كاملة 10 مل (لكل لوحة)، حتى تصل إلى التقاء 80-90%، وعندما يمكن أن تريبسينيزيد وباساجيد أو المستخدمة لفحص إفراز الأنسولين.</li>
	<li>
يوم 1: نضح وسائط الإعلام ويغسل خلايا مرة واحدة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً. إضافة 0.5 مل التربسين (0.025%) المخفف 1:1 في 0.5 مل برنامج تلفزيوني تريبسينيزي الخلايا واحتضان لمدة 3-4 دقائق في 37 ˚C. قم بإلغاء تنشيط التربسين بإضافة 9 مل كامل وسائل الإعلام ونقل الخلايا إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل من بيبيتينج.</li>
	<li>بيليه الخلايا بالطرد المركزي، وإعادة تعليق بيليه الخلية في حوالي 5 مل وسائط جديدة.</li>
	<li>تأخذ 10 ميليلتر من الخلايا إعادة تعليق وتخلط مع 10 ميليلتر تريبان الأزرق صبغ الحيوية للتحقق من صلاحية الخلية. عد الخلايا الحية والميتة في 10 ميليلتر من هذا الخليط باستخدام هيموسيتوميتير. ينبغي أن يكون مستوى صلاحية أكثر من 90 في المائة. تمييع الخلايا إعادة معلقة في وسائط جديدة للخلايا 1 مليون كل مل.</li>
	<li>قبل المغلفة بذور الخلايا الإضافية-1E 0.5 مل كل بئر في بولي-L-يسين لوحة 24-جيدا، وفي كثافة الخلايا 500,000/جيدا.</li>
	<li>
يوم 2: قم بإزالة الوسائط ح 18-24 بعد الطلاء وإضافة 500 ميليلتر/بئر جديدة RPMI 1640 الوسائط. احتضان الخلايا لآخر 24 ساعة للسماح للخلايا التعافي تماما من الخطوة السابقة باساجينج. ويسمح هذا الوقت الإضافي الخلايا إلى نشر على لوحة زراعة الأنسجة.</li>
</ol>2-الأنسولين إفراز الإنزيم (اليوم الثالث)
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت كربوفانتسي: مم 132.2 كلوريد الصوديوم، 3.6 ملم بوكل، 5 مم ناكو3، 0.5 مم نة2بو40.5 مم مجكل2، كاكل 1.5 مم2والبومين المصل البقري 0.001 غ/مل (BSA)، الرقم الهيدروجيني 7.4.</li>
	<li>نضح وسائل الإعلام من الخلايا ويغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني المعالجون مسبقاً.</li>
	<li>الخطوة المجاعة الجلوكوز، إضافة 450 ميليلتر/بئر كربوفانتسي (التي تحتوي على جيش صرب البوسنة) دون الجلوكوز ح 1 في 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>أثناء الخطوة المجاعة الجلوكوز، يعد تخفيف المسلسل من drug(s) في كربوفانتسي التي تحتوي على 200 ملم الجلوكوز (تركيز 10 x).<ol>
<li>تعد المخدرات في 10 × التركيز النهائي في كربوفانتسي تستكمل مع الجلوكوز 200 ملم (أيضا 10 × تركيز الجلوكوز الفحص النهائي). إذا كان المخزون المخدرات (بالإضافة إلى 10 وأضاف x الجلوكوز) هو في [دمس]، تأكد من يتم الاحتفاظ بنسبة مئوية [دمس] متسقة في جميع أنحاء المقايسة (النسبة المئوية النهائية من الناحية المثالية لأقل من 0.1% [دمس]).</li>
		<li>لعلاجات الدوبامين وكوينبيرولي، استخدام المخدرات مقايسة الختامية تركيز يتراوح من 100 ميكرومتر إلى 100 م (من أعلى إلى أدنى تركيز)، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة التي تحتوي على أي دواء. بروموكريبتين، استخدم تركيز تحليل نهائي يتراوح بين 10 ميكرون إلى 10:00 م، مع النقطة الأخيرة استجابة الجرعة يجري التحكم خالية من المخدرات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>بعد الجلوكوز المجاعة، إضافة تخفيف المسلسل المخدرات للمقايسة لإنتاج استجابة جرعة.</li>
	<li>إضافة 50 ميليلتر/جيدا من كل تمييع المسلسل إلى الآبار المقابلة (مقايسة إجمالي حجم 500 ميليلتر).</li>
	<li>الخطوة الجلوكوز التحفيز، احتضان الخلايا مع تخفيف المخدرات كل منها مسلسل (حضور الجلوكوز 20 ملم) لمدة 90 دقيقة في ˚C/5% 37 شركة2- وتشمل مجموعة من الآبار التحكم: (1) تحفيز مع الجلوكوز 20 مم وحدها في الغياب أي المخدرات الإضافية و (2) الخلايا التي لا تحفز بالمخدرات لا الجلوكوز (الذي يوفر معدل إفراز القاعدية).</li>
	<li>بعد هذه الخطوة التحفيز، بعناية إزالة سوبيرناتانتس (استخدام مباشرة أو مخزن في 4 ˚C). ملاحظة: خطوة الطرد المركزي لطيف 5 دقائق إضافية (600 x ز، 1 دقيقة) يمكن إدخال في هذه المرحلة لإزالة أي الخلايا المتبقية في supernatants المقايسة.</li>
</ol>3-هترف لإفراز الأنسولين التدبير
<ol><li>تمييع الإنزيم supernatants 01:10 في كربوفانتسي (بدون جيش صرب البوسنة)، يفضل أن يكون ذلك في لوحات واضحة 96-جيدا.</li>
	<li>إعداد المنحنى المعياري الأنسولين للمقايسة الأنسولين هترف (الجدول 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>حل الأسهم القياسية 500 نانوغرام/مليلتر</td>
			<td>تخفيف المسلسل</td>
			<td>تعمل [الأنسولين] نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 7</td>
			<td>30 ميليلتر الأسهم + 140 ميليلتر كربوفانتسي</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 6</td>
			<td>30 ميليلتر STD 7 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 5</td>
			<td>30 ميليلتر STD 6 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 4</td>
			<td>30 ميليلتر STD 5 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 3</td>
			<td>30 ميليلتر STD 4 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 2</td>
			<td>30 ميليلتر STD 3 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 1</td>
			<td>30 ميليلتر الأمراض المنقولة جنسياً 2 + 45 كربوفانتسي ميليلتر</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>الأمراض المنقولة جنسياً 0</td>
			<td>كربوفانتسي ميليلتر 45</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">ملاحظة: تقييم الأمراض المنقولة جنسياً 500 نانوغرام/مليلتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1. مسلسل تخفيف جعل المنحنى القياسي الأنسولين.
<ol start="3"><li>إضافة العينات المنحنى المعياري و supernatants المقايسة المخفف للوحة هترف. يمكن القيام بقياس الأنسولين يفرز من هترف في 96-بئر أو شكل لوحة 384، حسنا، مع الأخذ في الاعتبار حجم مقايسة لديه إعادة ضبط. استخدام 10 ميليلتر/بئر عينة في أبيض 96-بئر النصف-منطقة لوحات أو 5 ميليلتر/بئر في لوحة صغيرة الحجم، مستديرة القاع أبيض 384-جيدا (انظر الجدول للمواد).</li>
	<li>إعداد مزيج الأجسام المضادة في الكشف عن المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد) في إحدى الجهات مانحة 1:2 (كريبتاتي)/نسبة يقبلون (XL-665). ملاحظة: كذلك تفاصيل محددة حول الإنزيم هترف المتوفرة من الشركة المصنعة.</li>
	<li>إضافة مزيج الأجسام المضادة للانزيم في 30 ميليلتر/جيدا (على شكل 96 جيدا--لوحة فحص) أو 15 ميليلتر/جيدا (لتنسيق مقايسة لوحة 384-جيدا).</li>
	<li>ختم اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قراءة لوحة بعد ح 2، ح 4، و/أو الحضانة بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة باستخدام قارئ لوحة ووحدة الألياف البصرية هترف المناسبة (337 665 620 شمال البحر الأبيض المتوسط) (انظر الجدول للمواد وإرشادات الشركة المصنعة). تعيين بدء التكامل في المايكروثانيه 60 والوقت التكامل في المايكروثانيه 400-200 استخدام ومضات كل بئر. ملاحظة: تستند هذه المعلمات إلى استخدام قارئ معين. قراءات في 620 نانومتر و 665 شمال البحر الأبيض المتوسط قد تختلف بين مختلف الصكوك. وهذا أحد الأسباب التي نقترح استخدام نسبة 665/620. في حساب هذه النسبة، أي الاختلافات المحتملة من قارئ إلى قارئ سوف يكون تطبيع وتوفير قيم متسقة بغض النظر عن الوسيلة المستخدمة لقياس هترف.</li>
</ol>4-بيانات التحليل والتطبيع
<ol><li>حساب تركيزات الأنسولين من الآبار بالانزيم عن طريق استقراء راتيوميتريك قراءات الأسفار (665 nm nm/620) إلى ثانية ترتيب متعدد الحدود منحنى (الشكل 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> الشكل 2 : المنحنى المعياري الأنسولين. مخزون الأنسولين البشري من تركيزات معروفة استخدمت لإنشاء المنحنى المعياري الأنسولين. نسب هترف الناتجة (665 نانومتر/620 نانومتر) وقد تآمروا ضد الأنسولين تركيزات. البيانات أفضل احتواء على منحنى ترتيب متعدد الحدود التربيعية ثانية (ص2 = 0.99996). وهذا منحنى قياسي ممثل. أشرطة الخطأ = sem. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<ol start="2"><li>مع البيانات المستنتجة نانوغرام/مل للأنسولين ويفرز، وتطبيع (الأنسولين يفرز استجابة لتزايد تركيزات يجند) إلى متوسط قيمة % الأنسولين أقصى إفراز الإنزيم الآبار (شرط وحدها الجلوكوز من عيار 20 ملم).</li>
	<li>استخدام ملائمة منحنى (ص2) من تجربة واحدة لحساب التباين الصفائحية. داخل التجربة، تستمد القيم الفردية2 R التكرارات داخل التجريبية، يسمح حساب الخطأ المعياري للوسط للمنحنى تناسب.</li>
	<li>لتحديد الاختلاف إينتيربلاتي، استخدام البيانات من ثلاثة على الأقل من التجارب الفردية لحساب الخطأ المعياري للوسط بقيمة2 R المنحنى الجماعية.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

ونحن نشكر بيار نيكولا (المقايسة سيسبيو) للحصول على مشورة مفيدة والدكتور بيير ماكلير (جامعة جنيف) لسخاء تقديم الخلايا الإضافية-1E. تم دعم هذا العمل بتمويل من وزارة الدفاع (منحة PR141292 إلى Z.F.)، جون ف. وألف-نانسي اميرلينج الصندوق في مؤسسة بيتسبرغ (إلى Z.F.).

تحليل الأنسولين هترف الموصوفة هنا يوفر نظام سريع وفعال لقياس إفراز الأنسولين من نظام قائم على الخلايا المزروعة. من بين أهم مزاياها، يوفر هذا التحليل إشارة خلفية منخفضة بسبب ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى ذلك، ونحن قد أكدت أن إشارة هترف مستقرة لفترات طويلة من الزمن (> ح 24)<sup clas...

وقد جرى ضبطه تنظيم استقلاب الطاقة بهرمون الابتنائية رئيسية، الأنسولين. الأنسولين هو توليف وصدر عن خلايا البنكرياس بيتا ردا على مستويات الغلوكوز خارج الخلية زيادة. مشغلات الأنسولين المفرج عنهم امتصاص الجلوكوز من الأنسجة حساسة للأنسولين1،2. الناحية الفسيولوجية، وهذا يرتبط بارتفاع تركيز الجلوكوز بعد تناول وجبة، متبوعاً بإفراز الأنسولين لتنظيم امتصاص الجلوكوز. اضطرابات في التوازن الجلوكوز تؤدي إلى الاعتلالات الأيضية التي توجت بمقاومة الأنسولين، وفي نهاية المطاف في بداية نوع 2 مرض السكري2،،من34.
على الرغم من إفراز الأنسولين وقد درست على نطاق واسع، وآلياتها التنظيمية تظل غير مفهومة. وكان مجالاً حيويا للتحقيق تحديد رواية المغيرون من إفراز الأنسولين من خلايا بيتا5،6،،من78. وتتطلب هذه الدراسات إلى فهم أفضل للعلاقة اقتران بين تنشيط الجلوكوز وإفراز الأنسولين. ولذلك كان من الضروري القدرة على دقة رصد وقياس مستويات إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). حتى الآن، ومع ذلك، سوى عدد محدود من الأساليب متاحة للسماح للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية باستخدام خطوط الخلايا إفراز الأنسولين و/أو جزيرات البنكرياس. واحد هو radioimmunoassay (ريا)، الذي يستخدم الأنسولين معلم النظائر المشعة والأجسام المضادة. وتشمل أوجه القصور الرئيسية في هذا النهج قضايا السلامة بسبب معالجة والتخلص من المواد المشعة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب ذات العمالة الكثيفة، التي تشمل الغسيل الطويل وحضانة خطوات متعددة. المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) هو نهج آخر مكلف وكثيفة العمالة التي تستخدم الأجسام المضادة لاكتشاف الأنسولين. التباين في الانتماءات جسم وكفاءة الاعتراف بالانسولين تعمل على الحد من العوامل لهذا الأسلوب، ويمكن أن تؤثر على إمكانية تكرار نتائج نتائج. أليسا ولا ريا صمم لتجارب الفائق. الفاسكرين مقايسة متجانسة المستخدمة لكشف وقياس مستويات إفراز الأنسولين. وتستند التكنولوجيا الفاسكرين تحويل الأكسجين المحيطة إلى دولة القميص الأوكسجين السعادة التي يمكن أن تتفاعل مع الأنواع تشيميلومينيسسينت، أدى إلى توليد تشيميلومينيسسينسي. نظراً للفحص متجانسة، تم القضاء على العديد من الخطوات الغسيل المرتبطة ريا وإليزا. عدم استقرار إشارة نظراً لطبيعة رد الفعل غير عاملاً يحد من التي قد تؤثر قراءات المقايسة. (TR-الكماشة، وضعته هييدوك والزملاء9، نهج متجانس آخر لقياس الأنسولين استناداً إلى ربط اثنين أضداد منفصل لمختلفة [ابيتوبس] في جزيء الأنسولين. الأضداد: هي كل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتبطة كيميائيا لمزدوجة مع قصيرة متكاملة واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي يتدلى. يجمع لهم ملزمة من الأجسام المضادة للأنسولين ويؤدي إلى مزدوجة الاتجاه الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. كل جسم مضاد يرتبط أيضا مع fluorophore المانحة أو يقبلون كل منهما، ورابطة الحمض النووي مزدوج يجمع بين هذه فلوروفوريس لتوليد فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق). ومع ذلك، واحد الحد المحتملة من TR-الكماشة، تقع على عاتق الحنق نفسه. قد يؤدي عدم القدرة على سرعة تبديد fluorescence الخلفية أثناء عملية التفاعل الحنق إلى مستويات عالية نسبيا من الأسفار الخلفية وإشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء داخل المقايسة. ولذلك، لا يزال موجوداً حاجة مقايسة موثوق بها وقوية وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة الفائق.
توجت التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفيزياء الحيوية في تطوير متجانسة الأسفار وقت حل الطاقة الرنين نقل (هترف) على أساس المقايسة. على وجه التحديد، بينما نقل الطاقة داخل الإنزيم قد يمكن وصفها بأنها المستندة إلى الحنق، أكثر دقة، هترف يعتمد على التﻷلؤ الطاقة الرنين نقل (بعيد)10 الذي هو غير الإشعاعي نقل الطاقة بين المانحين ويقبلون الأنواع11،،من1213. هذا التمييز مهم، منذ توقيت الأسفار أو تبريد استناداً إلى الحنق التفاعل يختلف كثيرا مما عليه للانتقال، على الرغم من أن يمكن استخدام نفس أنواع النابضة للحنق والانتقال. وعلاوة على ذلك، استخدام التراب النادر لانثانيدات كريبتاتي المركبات مثل اليوروبيوم أو كريبتاتي تيربيوم في هترف تنتج fluorescence طويلة نصف عمر12،14. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها للأخذ بتأخير زمني (µsec) بين المانحين الإثارة، وقياس الانبعاثات من يقبلون (أي حل وقت الفحص). يسمح هذا التأخير الزمني لوقت كاف للأسفار الخلفية لتبديد قبل قياس يقبلون الانبعاثات الأسفار. ونتيجة لذلك، هو قراءات مجاناً من الأسفار غير محددة، وهكذا، هو تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، طبيعة متجانسة هترف يلغي الحاجة للغسيل الخطوات يغسل الأنواع غير منضم، مما يجعل المقايسة الكثير أكثر سرعة من أليسا أو الأساليب المستندة إلى ريا.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> رقم 1: التخطيطي لآلية لاكتشاف الأنسولين هترف- الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها بشكل مستقل اثنين تعترف على وجه التحديد، وربط للأنسولين في مواقع منفصلة. يتم مترافق هذه الأجسام المضادة إلى الجهة المانحة كريبتاتي يوروبيوم أو يقبلون XL665. الإثارة للجهات المانحة في نتائج نانومتر 337 في الانبعاثات في 620 نانومتر. نقل الطاقة الناتجة عن أسباب XL665 تنبعث منها في طول موجي أطول، 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام نهج القائم على هترف لتحديد مستويات نظام خدمات التأمين الحكومية من الخلايا الإضافية-1E، راسخة الأنسولين إفراز المستمدة من خلية بيتا الفئران insulinoma الخلية خط15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا التحليل لتحديد التشكيل الجانبي الدوائي من المنظمين الجزيئية لإفراز الأنسولين. نقوم بتطبيق هذا التحليل الأنسولين المستندة إلى هترف لدراسة الدوبامين د2-مثل تنظيم مستقبلات نظام خدمات التأمين الحكومية. وأظهرت الدراسات زيادة أن الدوبامين العصبي منظم هام لنظام خدمات التأمين الحكومية8،،من1617،،من1819،20، 21 , 22-الدوبامين يؤثر على نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة أوتوكريني/باراكريني سلبية عبر إجراءات على الدوبامين د2-مثل مستقبلات (د2، د3، د4 مستقبلات) أعربت في سطح خلايا البنكرياس بيتا8 , 16 , 19-استخدام هذا الفحص، تأكيد دور الدوبامين في كمنظم سلبية لنظام خدمات التأمين الحكومية، وإثبات أن الدوبامين د2-مثل مستقبلات يضع بروموكريبتين وكوينبيرولي أيضا الحد من نظام خدمات التأمين الحكومية.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

الكشف عن إفراز الأنسولين ضروري لتوضيح آليات إفراز الخاضعة للتنظيم، وكذلك كما هو الحال في دراسات الأيض. على الرغم من أن العديد من فحوصات الأنسولين كانت موجودة منذ عقود، مبسطة الأخيرة ظهور التكنولوجيا فورستر الرنين الطاقة نقل (هترف) حل الوقت متجانسة إلى حد كبير هذه القياسات. وهذا هو مقايسة ضوئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة واستنساخه وقوية تعتمد على الأجسام المضادة مترافق ل fluorophores مشرق مع الانبعاثات طويلة الأمد التي يسهل حلها وقت "فورستر الرنين الطاقة نقل". وعلاوة على ذلك، اكتشاف الأنسولين هترف قابلة لتطوير فحوصات الفرز الفائق. هنا نستخدم هترف للكشف عن إفراز الأنسولين في الخلايا الإضافية-1E، خط خلية المستمدة من insulinoma الفئران. وهذا يسمح لنا تقدير المستويات القاعدية للأنسولين، وهذه التغييرات استجابة للتحفيز الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم هذا النظام اكتشاف الأنسولين لتأكيد دور الدوبامين كمنظم سلبية لإفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). بطريقة مماثلة أخرى الدوبامين د2-مثل يضع مستقبلات وكوينبيرولي وبروموكريبتين، خفض نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التركيز. نتائجنا إبراز فائدة تنسيق المقايسة الأنسولين هترف في تحديد دور المخدرات عديدة في نظام خدمات التأمين الحكومية وملفاتهم الدوائي.

علينا التحقق من صحة لدينا الإنزيم هترف الأنسولين عن طريق توليد منحنى المعياري الأنسولين استخدام معايير تنقية الأنسولين البشري من التركيزات المحددة مسبقاً (الشكل 2). جيل من المنحنى القياسي يسمح لنا باستقراء القراءات الأسفار راتيوميتريك، ومن ثم تحديد مست?...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

هنا، فإننا نقدم متجانسة وقت حل الحنق (هترف) كطريقة فعالة للكشف السريع عن الأنسولين يفرز من الخلايا.

متجانسة فورستر حل وقت الرنين الطاقة القائم على نقل التحليل للكشف عن إفراز الأنسولين

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Views.  University of Pittsburgh. هنا، فإننا نقدم متجانسة وقت حل الحنق (هترف) كطريقة فعالة للكشف السريع عن الأنسولين يفرز من الخلايا.

Video: Homogeneous Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioengineering

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

مقايسات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT المفسفرة الداخلية في الخلايا البشرية

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Developmental Biology

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Immunology and Infection

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biology

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

أحداث الإشارات داخل الخلايا وإفراز الهرمونات في الجزر الكاذبة البشرية

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في تشوهات الجزيرة ووظيفتها باستخدام بروتوكول Pseudoislet 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

متجانسة فورستر حل وقت الرنين الطاقة القائم على نقل التحليل للكشف عن إفراز الأنسولين

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

حساسة للغاية وسريع كشف الإسفار مع محلل الحنق المحمولة

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

مقايسات نقل طاقة الرنين Förster التي تم حلها بمرور الوقت لقياس بروتينات STAT المفسفرة الداخلية في الخلايا البشرية

تمايز الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات الجزر المنتجة للأنسولين

اليكتروتشيميلومينيسسينسي فحوصات للأجسام المضادة البشرية من جزيرة ليلى

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز

نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات

نظام الجزر الزائفة البشرية للتقييم المتزامن لديناميات الاستشعار الحيوي الفلوري وملامح إفراز الهرمونات