Gli autori non hanno nulla a rivelare.

1. INS-1E cellule: manutenzione e placcatura
<ol><li>Mantenere cellule INS-1E in un incubatore 37 ˚C/5% CO2 e coltivate con medium RPMI 1640 completati con 5% (v/v) inattivati siero bovino fetale, 2 mM L-Glutammina, 10 mM HEPES, piruvato di sodio di 1 mM, 100 U/mL di penicillina/streptomicina soluzione, 50 µM β-mercaptoetanolo. Della coltura di cellule in 10 mL di terreno completo RPMI 1640 (per piastra), finché non raggiungono la confluenza di 80-90%, quando possono essere tripsinizzate e attraversate o utilizzati per il dosaggio di secrezione di insulina.</li>
	<li>
1 ° giorno: Media di aspirare e lavare le cellule una volta con 5 mL di PBS preriscaldata. Aggiungere 0,5 mL di tripsina (0.025%) diluito 1:1 in 0,5 mL di PBS tripsinizzano le cellule e incubare per 3-4 min a 37 ° c. Disattivare tripsina aggiungendo 9 mL completo media e cellule di trasferimento di una provetta da centrifuga da 15 mL pipettando.</li>
	<li>Pellet di cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet cellulare nei mezzi di comunicazione fresco di circa 5 mL.</li>
	<li>Prendere 10 µ l di cellule ri-sospensione e mescolare con 10 µ l di colorante vitale tripan blu per verificare la vitalità cellulare. Contare le celle vivi e morte in 10 µ l di questa miscela utilizzando un emocitometro. Livello di redditività dovrebbe essere superiore al 90%. Diluire le cellule risospese in media fresco per 1 milione di cellule per mL.</li>
	<li>Le cellule di INS-1E 0,5 mL di seme per pozzetto in una poli-L-lisina prerivestiti piastra a 24 pozzetti, ad una densità di 500.000 cellule per pozzetto.</li>
	<li>
2 ° giorno: Rimuovere media 18-24 h dopo la placcatura e aggiungere 500 µ l/pozzetto di fresco RPMI 1640 media. Incubare le cellule per altre 24 ore consentire alle cellule di recuperare completamente dal passaggio precedente e passaging. Questo tempo aggiuntivo permette alle cellule di diffondere sulla piastra di coltura del tessuto.</li>
</ol>2. insulina secrezione Assay (giorno 3)
<ol><li>Preparare il tampone di KRB: 132,2 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 5mm NaHCO3, 0,5 mM NaH2PO4, 0,5 mM MgCl2, 1,5 mM CaCl2e 0,001 g/mL di sieroalbumina bovina (BSA), pH 7,4.</li>
	<li>Media da cellule di aspirare e lavare due volte con PBS preriscaldata.</li>
	<li>Per il passaggio di fame di glucosio, aggiungere 450 µ l/pozzetto KRB (contenente BSA) senza glucosio per 1 h a 37 ˚C/5% CO2.</li>
	<li>Durante la fase di inedia di glucosio, preparare diluizioni seriali delle droghe in KRB contenente 200 mM glucosio (10x concentrazione).<ol>
<li>Preparare droga a 10x la concentrazione finale in KRB completati con 200 millimetri di glucosio (anche 10 volte la concentrazione di glucosio finale del dosaggio). Se lo stock di droga (plus aggiunto 10 x glucosio) è in DMSO, assicurarsi che la percentuale di DMSO è mantenuto costante durante tutto il test (percentuale idealmente finale inferiore a 0.1% DMSO).</li>
		<li>Per i trattamenti di dopamina e quinpirole, utilizzare una gamma di concentrazione di farmaco dosaggio finale di 100 µM a 100 pM (dalla più alta alla più bassa concentrazione), con l'ultimo punto della dose risposta non contenente nessuna droga. Per la bromocriptina, utilizzare una gamma di concentrazione finale del dosaggio di 10 µM a 22, con l'ultimo punto della dose risposta essendo il controllo droga-libero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo aver fame di glucosio, aggiungere diluizioni seriali di droga per il dosaggio di produrre una reazione al dosaggio.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l/pozzetto di ciascuna diluizione seriale nei pozzetti corrispondenti (dosaggio totale volume 500 µ l).</li>
	<li>Per la fase di stimolazione del glucosio, incubare le cellule con le diluizioni seriali di rispettivi droga (in presenza di glucosio 20 mM) 90 min a 37 ˚C/5% CO2. Comprendono una serie di pozzetti di controllo: (1) stimolazione con 20 millimetri di glucosio da solo in assenza di qualsiasi farmaco aggiuntivo e (2) le cellule che vengono stimolate né droga né glucosio (che fornisce un tasso basale di secrezione).</li>
	<li>Dopo la fase di stimolazione, rimuovere con cautela i surnatanti (uso direttamente o conservare a 4 ° c). Nota: Un passo di centrifugazione delicata di ulteriori 5 minuti (600 x g, 1 min) può essere introdotti a questo punto per rimuovere tutte le cellule rimanenti nei surnatanti dosaggio.</li>
</ol>3. HTRF per misura la secrezione dell'insulina
<ol><li>Diluire il dosaggio surnatanti 01:10 in KRB (senza BSA), preferibilmente in piastre da 96 pozzetti chiaro.</li>
	<li>Preparare la curva standard di insulina per il dosaggio di insulina HTRF (tabella 1).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Soluzione standard stock 500 ng/ml</td>
			<td>Diluizioni seriali</td>
			<td>Lavoro [insulina] ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µ l stock + 140 µ l KRB</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 6</td>
			<td>30 µ l STD 7 + 45 µ l KRB</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 5</td>
			<td>30 µ l STD 6 + 45 µ l KRB</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 4</td>
			<td>30 µ l STD 5 + 45 µ l KRB</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 3</td>
			<td>30 µ l STD 4 + 45 µ l KRB</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 2</td>
			<td>30 µ l STD 3 + 45 µ l KRB</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 1</td>
			<td>30 µ l STD 2 + 45 µ l KRB</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>KRB 45 µ l</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Nota: STD Stock è 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Diluizioni seriali per rendere la curva standard di insulina.
<ol start="3"><li>Aggiungere i campioni di curva standard ed i surnatanti di dosaggio diluito alla piastra HTRF. La misurazione di insulina secreta da HTRF può avvenire in un formato di piastra 384 pozzetti, tenendo presente che il volume di dosaggio deve essere ri-regolato o un 96 pozzetti. Uso 10 µ l/pozzetto campione in bianchi 96 pozzetti metà-zona lastre o 5 µ l/pozzetto in un piatto bianco 384 pozzetti di basso volume, turno-fondo (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Preparare la miscela di anticorpi nel buffer di rilevamento (Vedi Tabella materiali) in un donatore di 1:2 (criptato) / rapporto accettore (XL-665). Nota: Ulteriori dettagli specifici circa l'analisi HTRF sono disponibili presso il produttore.</li>
	<li>Aggiungi mix di anticorpo per test a 30 µ l/pozzetto (per un formato di 96 pozzetti saggio) o 15 µ l/pozzetto (per un formato di test piastra 384 pozzetti).</li>
	<li>La piastra ed incubare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Leggere la piastra dopo 2h, 4h, e/o pernottamento incubazione con anticorpi usando il lettore di piastre e il modulo di ottica HTRF appropriato (337 665 620 nm) (Vedi Tabella dei materiali e le istruzioni del produttore). Impostare l'inizio di integrazione alle 60 µs e il tempo d'integrazione alle 400 µs. uso 200 lampeggia per pozzetto. Nota: Questi parametri sono stati basati sull'uso del nostro lettore particolare. La lettura a 620 nm e 665 nm possono variare tra i diversi strumenti. Questo è uno dei motivi che si consiglia di utilizzare il rapporto di 665/620. Nel calcolo di questo rapporto, eventuali differenze di potenziale dal lettore al lettore saranno normalizzati e forniscono valori coerenti indipendentemente lo strumento utilizzato per misurare HTRF.</li>
</ol>4. normalizzazione e analisi dei dati
<ol><li>Calcolare le concentrazioni di insulina nei pozzetti di saggio tramite estrapolazione di raziometrici letture di fluorescenza (665 nm/620 nm) a una secondo ordine polinomiale curva quadratica (Figura 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> Figura 2 : Curva standard insulina. Stock di insulina umana di concentrazioni note è stato utilizzato per generare la curva standard di insulina. I rapporti HTRF risultanti (665 nm / 620 nm) sono state tracciate contro le concentrazioni di insulina. I dati erano più adatta a una curva polinomiale quadratica di secondo ordine (R2 = 0.99996). Si tratta di una curva standard rappresentativa. Barre di errore = SEM. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Con i dati estrapolati come ng/mL di insulina secernuta, normalizzare (insulina secernuta in risposta all'aumento delle concentrazioni di ligando) al valore medio dei pozzi % insulina massima secrezione assay (stato solo del glucosio di 20 mM).</li>
	<li>Utilizzare la curva adatta (R2) da un singolo esperimento per calcolare la variazione di intraplacca. All'interno dell'esperimento, derivato i singoli valori di R2 dai duplicati intra-sperimentali, che consentano di calcolare l'errore standard della media per la curva.</li>
	<li>Per la determinazione della variazione interplacca, utilizzare i dati da almeno tre singoli esperimenti per calcolare l'errore standard della media per il valore di2 R della curva del collettivo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

Ringraziamo Nicolas Pierre (Cisbio analisi biologiche) per consigli utili e Dr. Pierre Maechler (Università di Ginevra) per fornire generosamente alle cellule INS-1E. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento dal dipartimento della difesa (grant PR141292 a Z.F.), John F. e Nancy A. Emmerling Fund della Fondazione Pittsburgh (a Z.F.).

Il dosaggio di insulina HTRF descritto qui offre un sistema rapido, efficiente per misurare la secrezione di insulina da un sistema basato su cellule coltivata. Tra i suoi più importanti vantaggi, questo saggio offre un segnale basso fondo dovuto l'alto rapporto segnale-rumore. Inoltre, abbiamo confermato che il segnale HTRF è stabile per lunghi periodi di tempo (> 24 h)7. Tuttavia, poiché gli anticorpi monoclonali di insulina-associazione raggiungere velocemente la saturazione di associazione ...

La regolazione del metabolismo energetico è messo a punto da un importante ormone anabolizzante, insulina. L'insulina viene sintetizzata e rilasciato da cellule beta pancreatiche in risposta ai livelli aumentati del glucosio extracellulare. L'insulina rilasciata innesca l'assorbimento di glucosio da tessuti insulino sensibili1,2. Fisiologicamente, questo è legato all'elevazione della concentrazione di glucosio dopo un pasto, seguita dalla secrezione di insulina per regolare l'assorbimento del glucosio. Perturbazioni nell'omeostasi del glucosio conducono ai danni metabolici che culmina nell'insulino-resistenza e, infine, nell'insorgenza del diabete di tipo 22,3,4.
Anche se la secrezione dell'insulina è stata studiata estesamente, suoi meccanismi regolatori rimangono poco compresi. Un'area critica di indagine è stata l'identificazione di nuovi modulatori della secrezione di insulina dalle cellule beta5,6,7,8. Questi studi richiedono una migliore comprensione del rapporto accoppiamento tra stimolazione del glucosio e la secrezione di insulina. Di conseguenza, la possibilità di monitorare accuratamente e quantificare i livelli di secrezione insulinica glucosio-mediata (GSIS) è stato essenziale. Fin qui, tuttavia, solo un numero limitato di metodi era disponibile per consentire la quantificazione di GSIS utilizzando linee di cellule secernenti insulina e/o isole pancreatiche. Uno è la radioimmunoanalisi (RIA), che utilizza il radioisotopo-etichetta dell'insulina e gli anticorpi. Le principali limitazioni di questo approccio includono problemi di sicurezza dovuto la manipolazione e lo smaltimento di materiali radioattivi. Inoltre, questo metodo è laborioso, che coinvolgono più lunga lavaggio e le fasi di incubazione. Analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è un altro approccio costoso e laborioso che utilizza anticorpi per il rilevamento di insulina. Variazione di affinità dell'anticorpo e dell'efficienza di riconoscere insulina stanno limitando i fattori di questo metodo e può influenzare la riproducibilità dei risultati. ELISA, né RIA è stato progettato per esperimenti di alto-rendimento. AlphaScreen è un dosaggio omogeneo utilizzato per il rilevamento e la misurazione dei livelli di secrezione dell'insulina. AlphaScreen tecnologia si basa sulla conversione dell'ossigeno ambientale in uno stato di singoletto eccitato ossigeno che possa reagire con specie a chemiluminescenza, conseguente generazione di chemiluminescenza. Perché il test sia omogeneo, molti i passaggi di lavaggio associato a RIA ed ELISA sono eliminati. Tuttavia, l'instabilità del segnale a causa della natura della reazione è un fattore limitante che può influenzare la lettura del test. (TR-tenaglia, sviluppato da Heyduk e colleghi9, è un altro approccio omogeneo alla misura dell'insulina basata sul legame degli anticorpi separati due epitopi diversi della molecola di insulina. Gli anticorpi sono ogni chimicamente legata al doppio DNA incagliato con strapiombi di DNA incagliati singoli complementari breve. Associazione degli anticorpi all'insulina li riunisce e porta ad un duplex di DNA incagliato doppio. Ogni anticorpo inoltre è associato con un fluoroforo donatore o accettore rispettivo, e l'associazione del duplex DNA riunisce questi fluorofori per generare il trasferimento di energia per risonanza (FRET). Uno dei potenziale limiti di TR-tenaglia, spetta tuttavia con il tasto stesso. L'incapacità di dissipare rapidamente fluorescenza di fondo durante la reazione di FRET può portare a livelli relativamente alti di fluorescenza di fondo e un basso rapporto segnale-rumore all'interno del dosaggio. Pertanto, sia ancora necessario per un'analisi affidabile, robusta e conveniente per quantificare GSIS in un modo ad alta velocità.
Gli avanzamenti recenti nella biofisica sono culminati nello sviluppo di un test di trasferimento (HTRF) basata risonanza energia omogenea fluorescenza risolta in tempo. In particolare, mentre l'energia di trasferimento all'interno l'analisi può essere descritto come basato su FRET, più precisamente, che HTRF si basa sulla luminescenza energia risonanza trasferimento (LRET)10 che è il non-radiative trasferimento di energia tra il donatore e accettore specie11,12,13. Questa distinzione è importante, poiché i tempi di una fluorescenza o tempra base FRET interazione è molto diversa da quella per LRET, anche se gli stessi tipi di gating possono essere utilizzati per FRET e LRET. Inoltre, l'uso di terre rare lantanidi cryptate composti quali europio o terbio cryptate in HTRF produce fluorescenza lunga emivita12,14. Questo offre un vantaggio unico dell'introduzione di un tempo di ritardo (µ sec) tra eccitazione del donatore e la misurazione del livello di emissione l'accettore (cioè, risolta in tempo saggio). Questo ritardo consente per un tempo sufficiente per la fluorescenza di fondo dissipare prima misurazione della fluorescenza emissione accettore. Di conseguenza, la lettura è libera di fluorescenza aspecifica e così, si ottiene un elevato rapporto segnale-rumore (Figura 1). Inoltre, la natura omogenea di HTRF Elimina la necessità per i passaggi di lavaggio per lavare via le specie non associate, che rende l'analisi molto più rapido rispetto ELISA o metodi basati su RIA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figura 1: schematica del meccanismo per il rilevamento di insulina HTRF. Due anticorpi monoclonali indipendentemente generati specificamente riconoscono e si legano all'insulina presso siti separati. Questi anticorpi sono coniugati per il donatore cryptate europio o l'accettore XL665. Eccitazione del donatore a 337 risultati nm in emissione a 620 nm. Il trasferimento di energia provoca XL665 a emettere ad una lunghezza d'onda, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un approccio basato su HTRF per determinare i livelli di GSIS dalle cellule INS-1E, una consolidata insulina-secrezione beta cellula-derivato ratto insulinoma cella linea15. Inoltre, questo dosaggio può essere usato per identificare il profilo farmacologico di molecolari regolatori della secrezione dell'insulina. Applichiamo questo dosaggio di insulina basata su HTRF per esaminare la dopamina D2-come regolazione del recettore di GSIS. Sempre più studi hanno rivelato che la dopamina del neurotrasmettitore è un regolatore importante di GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamina colpisce GSIS in modo autocrino/paracrino negativo tramite azioni sulla dopamina D2-come i ricevitori (D2, D3, ricevitori4 D) espressi sulla superficie delle cellule pancreatiche beta8 , 16 , 19. usando questa analisi, abbiamo conferma del ruolo di dopamina come un regolatore negativo di GSIS e dimostrare che la dopamina D2-come bromocriptina agonisti del recettore e quinpirole ridurre anche GSIS.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

La rilevazione della secrezione dell'insulina è fondamentale per illuminante meccanismi di secrezione regolata anche negli studi di metabolismo. Anche se numerosi saggi di insulina sono esistite per decenni, il recente avvento di tecnologia tempo-risolta omogenea del Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) ha notevolmente semplificato queste misurazioni. Questo è un saggio di ottico rapido, conveniente, riproducibile e robusto affidamento anticorpi coniugati a fluorofori luminose con emissione di lunga durata che facilita risolta in tempo Förster Resonance Energy Transfer. Inoltre, rilevamento di insulina HTRF è favorevole per lo sviluppo di saggi di screening ad alta resa. Qui usiamo HTRF per rilevare la secrezione dell'insulina in cellule INS-1E, una linea cellulare derivata da insulinoma del ratto. Questo ci permette di stimare i livelli basali di loro cambiamenti in risposta a stimolazione del glucosio e dell'insulina. Inoltre, utilizziamo questo sistema di rilevazione di insulina per confermare il ruolo della dopamina come un regolatore negativo della secrezione insulinica glucosio-mediata (GSIS). In modo simile, altri di dopamina D2-come agonisti del recettore, quinpirole e Bromocriptina, ridurre GSIS in un modo dipendente dalla concentrazione. I nostri risultati evidenziano l'utilità del formato di dosaggio di insulina HTRF nel determinare il ruolo dei numerosi farmaci in GSIS e loro profili farmacologici.

Abbiamo validato la nostra analisi HTRF insulina generando una curva standard di insulina utilizzando standard di insulina umana purificata delle concentrazioni predefiniti (Figura 2). Generazione della curva standard ha permesso di estrapolare le letture di fluorescenza raziometrici e quindi a determinare i livelli di insulina secreta in risposta ai trattamenti farmaco (Figura 2). Variazione di intraplacca per adattamento della ...

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Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.

Förster Time-resolved omogeneo risonanza energia basati su trasferimento test per la determinazione della secrezione dell'insulina

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K Views.  University of Pittsburgh. Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.

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Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Ricerca

Biochimica

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bioingegneria

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

Biologia dello sviluppo

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

Saggi di elettrochemiluminescenza autoanticorpi anti-umano dell'isolotto

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

Immunologia e infezioni

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Biologia

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

Misurazione della secrezione relativa dell'insulina utilizzando un surrogato Luciferase co-secreted

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Eventi di segnalazione intracellulare e secrezione ormonale in pseudoisole umane

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

Autore in primo piano: Indagine sulle anomalie e sulla funzione delle isole con un protocollo Pseudoislet 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

Förster Time-resolved omogeneo risonanza energia basati su trasferimento test per la determinazione della secrezione dell'insulina

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Altamente sensibile e rapido fluorescenza Detection con un portatile FRET Analyzer

Automated acustico di erogazione per la diluizione seriale di Peptide Agonisti in potenza Determinazione Assays

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

Saggi di elettrochemiluminescenza autoanticorpi anti-umano dell'isolotto

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

Misurazione della secrezione relativa dell'insulina utilizzando un surrogato Luciferase co-secreted

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali

Sistema di pseudoisole umane per la valutazione sincrona della dinamica dei biosensori fluorescenti e dei profili secretori ormonali