저자는 공개 없다.

1. 기능-1E 셀: 유지 보수 및 도금
<ol><li>기능-1E 셀 습도 37 ˚C/5% CO2 인큐베이터 고 RPMI 1640 매체와 교양 5% (v/v) 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 m m L-글루타민, 10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린/스와 보완 유지 솔루션, 50 µ M β-mercaptoethanol입니다. 80-90%의 합류를 도달할 때까지, 그들은 수 있는 trypsinized 및 passaged 또는 인슐린 분 비 분석 결과 대 한 사용 하는 경우 셀 (접시), 당 10 mL 전체 RPMI 1640 매체에 문화.</li>
	<li>
주 1: 미디어를 발음 하 고 셀 미리 따뜻하게 PBS의 5 mL로 한 번 씻어. 트립 신 (0.025%)의 0.5 mL 희석 1:1 0.5 ml PBS 셀 trypsinize 37 ˚C에서 3-4 분 동안 품 어를 추가 합니다. 추가 하 여 9 mL 전체 미디어 전송 셀 15 mL 원심 분리기 튜브를 pipetting으로 트립 신을 비활성화 합니다.</li>
	<li>원심 분리에 의해 세포를 작은 고 다시 약 5 mL 신선한 매체에서 셀 펠 릿을 일시 중단.</li>
	<li>다시 일시 중단 된 세포의 10 µ L 고 10 µ L 세포 생존 능력에 대 한 확인을 Trypan 블루 중요 한 염료 혼합. 10 µ L hemocytometer를 사용 하 여이 혼합의에 라이브 하 고 죽은 세포를 계산 합니다. 생존 수준 90% 이상 이어야 한다입니다. ML 당 1 백만 세포에 신선한 미디어에 다시 정지 셀을 희석.</li>
	<li>폴 리-L-리 신에 잘 당 종자 0.5 mL 기능-1E 셀 전 24-잘 접시, 500, 000 셀/잘의 조밀도에 코팅.</li>
	<li>
주 2: 미디어 18-24 h를 제거 후 도금 및 신선한 RPMI 1640 미디어의 500 µ L/잘 추가. 이전 passaging 단계에서 완벽 하 게 복구 하 셀 수 있도록 또 다른 24 h에 대 한 셀을 품 어. 이 추가 시간 조직 문화 접시에 확산 하기 위해 셀 수 있습니다.</li>
</ol>2. 인슐린 분 비 분석 결과 (3 일)
<ol><li>기계 버퍼 준비: 132.2 m m NaCl, 3.6 m m KCl, 5mm NaHCO3, 0.5 m m NaH2포4, 0.5 m m MgCl2, 1.5 m m CaCl2및 0.001 g/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA), pH 7.4.</li>
	<li>셀에서 미디어를 발음 하 고 미리 데워 공영으로 두 번 씻어.</li>
	<li>포도 당 기아 단계 37 ˚C/5% CO2450 µ L/잘 기계 (포함 BSA) 없이 1 시간에 대 한 포도 당을 추가 합니다.</li>
	<li>포도 당 기아 단계 동안 준비 200 m m를 포함 하는 기계에 나타나는데의 직렬 희석 포도 당 (10 배 농도).<ol>
<li>200 mM 포도 당 (또한 10 최종 분석 결과 포도 당 농도 배)으로 보충 하는 기계에 최종 농도 x 10에서 마약을 준비 합니다. 경우 약 재고 (추가 10 플러스 포도 당 x)는 DMSO, DMSO 비율 분석 결과 (이상적으로 최종 비율 0.1 %DMSO 미만)에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 있는지 확인.</li>
		<li>치료를 위해 도파민, quinpirole, 100 100 µ M의 최종 분석 결과 약물 농도 범위를 사용 하 여 포함 하는 약 복용량 응답의 마지막 포인트 (가장 높은 것에서 낮은 농도), 오후. Bromocriptine, 마약류 통제 되는 복용량 응답의 마지막 지점으로 오후 10 시, 10 µ M의 최종 분석 결과 농도 범위를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포도 당 기아 후 마약 직렬 희석 생산 복용량 응답 분석 결과를 추가 합니다.</li>
	<li>해당 우물 (총 분석 결과 볼륨 500 µ L)를 각 직렬 희석의 50 µ L/우물을 추가 합니다.</li>
	<li>포도 당 자극 단계에 대 한 37 ˚C/5% CO에서 90 분 동안 각각 약 직렬 희석 (20 mM 포도 당)의 존재와 셀을 품 어2. 제어 우물의 세트를 포함: (1) 어떤 추가 약물 및 약물도 (이 분의 기저 속도 제공 합니다) 포도 당 자극도 (2) 세포의 부재에 혼자 20 mM 포도 당으로 자극.</li>
	<li>자극 단계 후 조심 스럽게 제거 supernatants (직접 사용 또는 저장소 4 ˚C에서). 참고: 추가 5 분 부드러운 원심 분리 단계 (600 x g, 1 분) 분석 결과 supernatants에 나머지 셀을 제거 하려면이 시점에서 소개 될 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. HTRF 측정 인슐린 분 비를
<ol><li>명확한 96 잘 접시에 선호 분석 결과 supernatants 1:10 (BSA) 없이 기계를 희석.</li>
	<li>HTRF 인슐린 분석 결과 (표 1)에 대 한 인슐린 표준 곡선을 준비 합니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>표준 재고 솔루션 500 ng/ml</td>
			<td>직렬 희석</td>
			<td>[인슐린] ng/ml 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 7</td>
			<td>30 µ l 주식 + 140 µ l 기계</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 6</td>
			<td>30 µ l 성병 7 + 45 µ l 기계</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 5</td>
			<td>30 µ l 성병 6 + 45 µ l 기계</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 4</td>
			<td>30 µ l 성병 5 + 45 µ l 기계</td>
			<td>9.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 3</td>
			<td>30 µ l 성병 4 + 45 µ l 기계</td>
			<td>3.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 2</td>
			<td>30 µ l 성병 3 + 45 µ l 기계</td>
			<td>1.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>표준 1</td>
			<td>30 µ l 성병 2 + 45 µ l 기계</td>
			<td>0.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>STD 0</td>
			<td>45 µ l 기계</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">참고: 표준 재고는 500 ng/ml</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 인슐린 표준 곡선을 만들기 위해 직렬 희석입니다.
<ol start="3"><li>HTRF 플레이트를 표준 곡선 샘플 및 희석된 분석 결과 supernatants를 추가 합니다. HTRF에 의해 인슐린 분 비의 측정 96 잘 또는 분석 결과 볼륨을 다시 조정 해야 하는 것을 명심 384-잘 플레이트 형식 수행할 수 있습니다. 사용 10 µ L/잘 96 잘 화이트 반-지역 접시 또는 384-잘 화이트 낮은 볼륨, 라운드-하단 플레이트에서 5 µ L/잘 샘플 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>항 체 탐지 버퍼에 혼합 준비 ( 재료의 표참조) 1:2 기증자 (cryptate)에서 / 수락자 (XL-665) 비율. 참고: 추가 HTRF 분석 결과 대 한 특정 정보는 제조 업체에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>30 µ L/잘 (96 잘 접시 분석 결과 형식) 또는 15 µ L/잘 (384-잘 접시 분석 결과 형식)에 대 한 분석 결과를 항 체 믹스를 추가 합니다.</li>
	<li>접시를 봉인 하 고 실 온에서 품 어.</li>
	<li>2h, 4h, 및 야간 보육 후 플레이트 리더와 적절 한 HTRF 광섬유 모듈을 사용 하 여 항 체 판 읽기 (337 665 620 nm) ( 테이블의 재료 및 제조 업체의 지침 참조). 60 µ s에 통합 시작을 설정 하 고 통합 시간 400 μ s. 사용 200 잘 당 깜박입니다. 참고: 이러한 매개 변수는 우리의 특정 리더의 사용에 근거 했다. 620에서 판독 및 665 nm 서로 다른 악기 사이 다를 수 있습니다. 이 665/620 비율을 사용 하는 것이 좋습니다 이유 중 하나입니다. 이 비율을 계산, 리더를 리더에서 어떤 잠재적인 차이 정규화 될 것 이다 하 고 HTRF를 측정 하는 데 사용 하는 악기에 관계 없이 일관 된 값을 제공 합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석 및 정규화
<ol><li>비율의 추정을 통해 분석 결과 우물의 인슐린 농도 계산 형광 판독 (665 nm/620 nm)는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 (그림 2).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig2.jpg"> 그림 2 : 인슐린 표준 곡선. 인간 인슐린 재고 알려진된 농도의 인슐린 표준 곡선을 생성 하기 위해 사용 되었다. 결과 HTRF 비율 (665 nm / 620 nm) 인슐린 농도 대 한 표시 했다. 데이터는 두 번째 순서 이차 다항식 곡선 적합 (R2 = 0.99996). 이것은 대표적인 표준 곡선 이다. 오차 막대 SEM. = <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>인슐린 분 비의 ng/mL로 추정 데이터 % 최대 인슐린 분 비 분석 결과 우물 (20 mM 포도 당 혼자 조건)의 평균 값 (ligand 농도 증가에 대 한 응답에서 분 비 되는 인슐린)를 정상화.</li>
	<li>Intraplate 변화를 계산 하는 단일 실험에서 곡선 적합 (R2)를 사용 합니다. 실험에서 맞는 곡선에 대 한 의미의 표준 오차 계산을 수 있도록 내 실험 중복에서 개별 R2 값을 파생.</li>
	<li>Interplate 변형 결정 집단 곡선의 R2 값에 대 한 의미의 표준 오차를 계산 하기 위해 적어도 3 개의 개별 실험에서 데이터를 사용 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

우리가 아낌없이 제공 하는 기능-1E 셀에 대 한 유용한 조언을 니콜라 피에르 (Cisbio 생물 검정) 및 박사 피에르 Maechler (제네바 대학) 감사 합니다. 이 작품은 국방부 (그랜트는 Z.F. PR141292), 그리고 존 F. 낸시 A. Emmerling 기금 (Z.F.)에 피츠버그 재단에서 자금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 HTRF 인슐린 분석 결과 교양된 셀 기반 시스템에서 인슐린 분 비를 측정 하는 신속 하 고 효율적인 시스템을 제공 합니다. 그것의 가장 중요 한 장점 중이 분석 결과 높은 신호 대 잡음 비율 때문에 낮은 배경 신호를 제공합니다. 또한, 우리는 시간의 연장된 기간에 대 한 HTRF 신호는 안정 확인 했습니다 (> 24 h)7. 그럼에도 불구 하 고, 인슐린 바인딩 단일 클론 항 체 ?...

에너지 대사의 규정 주요 단백 동화 호르몬, 인슐린에 의해 미세 하 게. 인슐린 합성 이며 췌 장 베타 세포 증가 세포 외 포도 당 수준에 대 한 응답에서에 의해 발표. 출시 된 인슐린 인슐린에 민감한 조직1,2포도 당 통풍 관을 트리거합니다. 생리학적으로,이 식사 후, 포도 당 통풍 관을 통제 하는 인슐린의 분 비에 의해 다음 포도 당 농도의 상승에 연결 됩니다. 포도 당 항상성 교란 인슐린 저항에 culminating 대사 장애가 발생할 고 궁극적으로 2 형 당뇨병2,,34의 발병에.
인슐린 분 비를 광범위 하 게 공부 했다, 하지만 그 규제 메커니즘 제대로 이해 남아 있습니다. 수 사의 중요 한 지역 베타 세포5,6,,78인슐린 분 비의 소설 변조기의 식별 되었습니다. 이러한 연구는 포도 당 자극 인슐린 분 비 사이의 결합 관계의 더 나은 이해 해야 합니다. 따라서, 정확 하 게 모니터링 하 고 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 수준을 계량 능력 필수 되었습니다. 그러나 날짜 하려면,, 방법의 제한 된 수만 셀 라인 인슐린 분 비 췌 장 독도 이용 GSIS의 정량화를 허용 하도록 사용할 수 없었습니다. 하나는 방사성 태그 인슐린과 항 체를 이용 하는 방사 면역 검정 법 (RIA)입니다. 이 방법의 주요 제한 사항 처리 및 방사성 물질의 안전 문제가 포함 됩니다. 또한,이 방법은 노동 집약, 여러 긴 세척 및 인큐베이션 단계를 포함 합니다. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 인슐린 검출을 위한 항 체를 이용 하는 또 다른 비용과 노동 집약적인 접근 이다. 항 체 친 화력 및 인슐린 인식의 효율 변화 요인이이 방법의 제한 그리고 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있습니다. 애 란도 리아 높은 처리량 실험을 위해 설계 되었습니다. AlphaScreen 균질 분석 결과 감지 하 고 인슐린 분 비의 수준 측정에 사용 되는. AlphaScreen 기술 화학의 세대의 결과로 chemiluminescent 종으로 대응할 수 있는 흥분된 산소 내의 상태로 주변 산소의 변환 기반으로 합니다. 분석 결과 균질 성 때문에, 많은 RIA와 ELISA 세척 단계는 제거 됩니다. 그러나, 반응의 특성상 신호의 불안정은 제한 요인 분석 결과의 판독에 영향을 미칠 수 있습니다. (TR-협공,9Heyduk와 동료 의해 개발 된 인슐린 분자에 다른 epitopes 두 개의 별도 항 체의 바인딩을에 따라 인슐린 측정에 다른 동종 접근 이다. 항 체는 짧은 상호 보완적인 단일 좌초 DNA 돌출부와 화학적으로 이중 연결 된 각 좌초 DNA. 인슐린 항 체의 바인딩 함께 그들을 제공 그리고 두 배 좌초 된 DNA 이중으로 이어집니다. 각 항 체는 또한 각 기증자 또는 수락자 fluorophore와 연결 하 고 DNA 이중의 협회 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)를 생성 하기 위해 이러한 fluorophores 함께 제공. 그러나 TR-협공의 한 가지 잠재적인 한계 자체 무서 워, 달려있다. 빠르게 무서 워 반응 동안 배경 형광을 발산 하지 못하는 배경 형광의 상대적으로 높은 수준 및 낮은 신호 대 잡음 비 분석 결과 내에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 필요 높은 처리량 방식에서 GSIS를 측정에 대 한, 강력한, 안정적이 고 비용 효율적인 분석 결과 대 한 여전히 존재 합니다.
물리학에서 최근의 진보는 균질 시간 해결 형광 에너지 공명 전송 (HTRF) 기반으로 분석 결과의 개발에서 남 중 했다. 특히, 에너지 내에서 전송 하는 동안 분석 결과 수 있습니다 무서 워 기반으로 설명 더 정확 하 게, 발광 에너지 공명 전송 (LRET)10 은 기증자와 수락자 사이 에너지의 비 복사 전달에 의존 하는 HTRF 종11,,1213. 이 차이 이후는 형광의 타이밍 중요, 또는 냉각 하는 기반으로 무서 워 상호 작용 LRET, 보다 훨씬 다른 무서 워 및 LRET 게이팅의 동일한 종류를 사용할 수 있습니다. 또한, 유로 퓸 등 희토류 란타넘족 cryptate 사용 하 여 화합물 또는 HTRF에 븀 cryptate 생산 긴 형광 반감기12,14. 이 여기 기증자와 수락자 (즉, 시간 확인 시험)에서 방출의 측정 사이 타임 딜레이 (무색하)의 도입의 독특한 장점을 제공합니다. 이 시간 지연의 수락자 방출 형광 측정 전에 사라지고 배경 형광에 대 한 충분 한 시간을 허용 합니다. 따라서, 판독은 일반적인 형광의 자유롭고 높은 신호 대 잡음 비율 달성 하므로, (그림 1). 또한, HTRF의 동질적인 특성 분석 결과 많이 만드는 언바운드 종 ELISA 또는 RIA 기반 방법 보다 더 빠른 씻어 세척 단계에 대 한 필요가 없습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> 그림 1: HTRF 인슐린 감지 메커니즘의 도식. 두 개의 독립적으로 생성 된 단일 클론 항 체는 특히 인식 하 고 별도 사이트에서 인슐린에 바인딩합니다. 이 항 체는 유로 퓸 cryptate 기증자 또는 수락자 XL665 활용 된. 여기 620에서 방출에 337 nm 결과에 기증자의 nm. 결과 에너지 전송 하면 더 긴 파장, 665에서 방출 하는 XL665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기, 우리는 자세한 프로토콜 제공 기능-1E 셀에서 GSIS의 수준을 결정 하는 HTRF 기반 방식을 사용 하 여를 위한 insulinoma 셀 선15쥐는 확고 인슐린 은닉 베타 세포 파생. 또한,이 분석 결과 인슐린 분 비의 분자 레 귤 레이 터의 약리 프로필을 식별 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리이 인슐린 HTRF 기반 분석 결과 도파민 D2를 검사 하는 적용-GSIS의 수용 체 규칙 처럼. 증가 연구는 신경 전달 물질 도파민 GSIS8,,1617,18,19,20, 의 중요 한 레 귤 레이 터 밝혀졌다 21 , 22. 도파민은 도파민 D2에 대 한 작업을 통해 부정적인 autocrine/paracrine 방식에서 GSIS를에 영향을 미치는-같은 수용 체 (D2, D3D4 수용 체) 베타 췌 장 세포8 의 표면에 표현 , 16 , 19. 우리 GSIS의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하 고 입증 하는이 분석 결과 사용 하 여, 도파민 D2-수용 체 주 작동 근 bromocriptine와 quinpirole 또한 GSIS 감소 같은.

<table><tbody><tr><td>96-well white half area plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82050-042</td><td></td></tr><tr><td>384-well white low-volume, round-bottom plate</td><td>Corning</td><td>15100157</td><td></td></tr><tr><td>Insulin High Range Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62IN1PEH&amp;nbsp;</td><td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX plate reader</td><td>BMG Labtech</td><td>FSX</td><td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Fisher Scientific</td><td>DY992</td><td>To seal plate while antibodies incubate</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11875-093</td><td>[+] L-glutamine</td></tr><tr><td>Trypsin 0.05%&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>156-30-080</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin solution 100x</td><td>Corning</td><td>30-002 CT</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M1348</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td><td>Gibco&amp;nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Dopamine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>8502</td><td></td></tr><tr><td>Bromocriptine mesylate</td><td>Tocris</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>(-)-Quinpirole hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma</td><td>276855</td><td></td></tr></tbody></table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

인슐린 분 비의 검출은 규제의 분 비 또한 연구에서 물질 대사의 elucidating 메커니즘에 대 한 중요 합니다. 비록 수많은 인슐린 분석 실험은 수십 년 동안 존재 했다, 균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 (HTRF) 기술의 최근 출현 방식이 크게이 측정을 간소화 하 게 됩니다. 이것은, 비용, 재현성, 신속 하 고 강력한 광학 분석 결과 오래 지속 방출 포스터 공명 에너지 전송 시간 해결 용이와 밝은 fluorophores에 활용 된 항 체에 의존. 또한, HTRF 인슐린 탐지 높은 처리량 검열 분석 실험의 개발에 대 한 순종입니다. 여기 우리는 기능-1E 셀, 쥐 insulinoma 파생 셀 라인에서에서 인슐린 분 비를 검색 하기 위해 HTRF를 사용 합니다. 인슐린과 포도 당 자극에 그들의 변화 기초 수준 추정 수 있습니다. 또한,이 인슐린 탐지 시스템 사용 하 여 포도 당 자극 인슐린 분 비 (GSIS)의 부정적인 레 귤 레이 터로 서 도파민의 역할을 확인 하. 비슷한 방식으로, 다른 도파민 D2-수용 체 주 작동 근, quinpirole, bromocriptine, 줄일 GSIS 농도 의존 방식에서 처럼. 우리의 결과 GSIS와 그들의 약리 프로필에 수많은 약물의 역할을 결정 HTRF 인슐린 분석 결과 형식 유틸리티를 강조 표시 합니다.

우리는 미리 정의 된 농도 (그림 2)의 순화 된 인간의 인슐린 표준을 사용 하 여 인슐린 표준 곡선을 생성 하 여 우리의 인슐린 HTRF 분석 결과 검증. 따라서 우리 비율 형광 수치를 추정 하는 것을 허용 하는 표준 곡선의 세대 하 고 다음으로 하는 약물 치료 (그림 2)에 대 한 응답 인슐린 분 비 수준을 결정. 커브 피팅 Intraplate 변형 ...

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Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

여기, 우리가 현재의 균질 시간 세포에서 분 비 하는 인슐린의 신속한 검출을 위한 효율적인 방법으로 무서 워 (HTRF) 해결.

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

homogeneous-time-resolved-frster-resonance-energy-transfer-based

Research

JoVE Journal

Medicine

9.1K 조회수.  University of Pittsburgh. 여기, 우리가 현재의 균질 시간 세포에서 분 비 하는 인슐린의 신속한 검출을 위한 효율적인 방법으로 무서 워 (HTRF) 해결.

비디오: Homogeneous Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and amino acids. However, the innate weak signal intensity of FRET sensors is a major challenge that prevents their application in various fields and makes the use of expensive, high-end fluorometers necessary. Previously, we built a cost-effective, high-performance FRET analyzer that can specifically measure the ratio of two emission wavelength bands (530 and 480 nm) to achieve high detection sensitivity. More recently, it was discovered that FRET sensors with bacterial periplasmic binding proteins detect ligands with maximum sensitivity in the critical temperature range of 50 - 55 &#176;C. This report describes a protocol for assessing sugar content in commercially-available beverage samples using our portable FRET analyzer with a temperature-specific FRET sensor. Our results showed that the additional preheating process of the FRET sensor significantly increases the FRET ratio signal, to enable more accurate measurement of sugar content. The custom-made FRET analyzer and sensor were successfully applied to quantify the sugar content in three types of commercial beverages. We anticipate that further size reduction and performance enhancement of the equipment will facilitate the use of hand-held analyzers in environments where high-end equipment is not available.

This protocol describes the rapid and highly sensitive quantification of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensor data using a custom-made portable FRET analyzer. The device was used to detect maltose within a critical temperature range that maximizes detection sensitivity, enabling practical and efficient assessment of sugar content.

휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

연구

생화학

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. Screening peptides affords an additional layer of complexity as conventional tip-based sample handling methods expose peptides to a large surface area of plasticware, providing an increased opportunity for peptide loss via adsorption. Preventing excessive exposure to plasticware reduces peptide loss via adherence to plastics and thus minimizes inaccuracies in potency prediction, and we have previously described the benefits of non-contact acoustic dispensing for in vitro high-throughput screening of peptide agonists1. Here we discuss a fully integrated automation solution for non-contact acoustic preparation of peptide serial dilutions in microtiter plates utilizing the example of screening for peptide agonists at the mouse glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). Our methods allow for high-throughput cell-based assays to screen for agonists and are easily scalable to support increased sample throughput, or to allow for increased numbers of assay plate copies (e.g., for a panel of more target cell lines).

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

생체공학

Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to cytokines and growth factors. STAT proteins are activated by tyrosine phosphorylation mediated mainly by JAKs. The abnormal activation of STAT signaling pathways is implicated in many human diseases, especially cancer and immune-related conditions. Therefore, the ability to monitor STAT protein phosphorylation within the native cell signaling environment is important for both academic and drug discovery research. The traditional assay formats available to quantify phosphorylated STAT proteins include western blotting and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). These heterogeneous methods are labor-intensive, low-throughput, and often not reliable (specific) in the case of western blotting. Homogeneous (no-wash) methods are available but remain expensive. 
Here, detailed protocols are provided for the sensitive, robust, and cost-effective measurement in a 384-well format of endogenous levels of phosphorylated STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699), and STAT6 (Y641) in cell lysates from adherent or suspension cells using the novel THUNDER time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer (TR-FRET) platform. The workflow for the cellular assay is simple, fast, and designed for high-throughput screening (HTS). The assay protocol is flexible, uses a low-volume sample (15 &#181;L), requires only one reagent addition step, and can be adapted to low-throughput and high-throughput applications. Each phospho-STAT sandwich immunoassay is validated under optimized conditions with known agonists and inhibitors and generates the expected pharmacology and Z'-factor values. As TR-FRET assays are ratiometric and require no washing steps, they provide much better reproducibility than traditional approaches. Together, this suite of assays provides new cost-effective tools for a more comprehensive analysis of specific phosphorylated STAT proteins following cell treatment and the screening and characterization of specific and selective modulators of the JAK/STAT signaling pathway.

Time-resolved F&#246;rster resonance energy transfer cell-based assay protocols are described for the simple, specific, sensitive, and robust quantification of endogenous phosphorylated signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3/4/5/6 proteins in cell lysates in a 384-well format.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

The Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT) signaling pathway plays a crucial role in mediating cellular responses to ...

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-Producing Islet Clusters

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and diabetes treatment. However, challenges remain in obtaining stem cell-derived beta cells that adequately mimic native human beta cells. Building upon previous studies, hPSC-derived islet cells have been generated to create a protocol with improved differentiation outcomes and consistency. The protocol described here utilizes a pancreatic progenitor kit during Stages 1-4, followed by a protocol modified from a paper previously published in 2014 (termed "R-protocol" hereafter) during Stages 5-7. Detailed procedures for using the pancreatic progenitor kit and 400 &#181;m diameter microwell plates to generate pancreatic progenitor clusters, R-protocol for endocrine differentiation in a 96-well static suspension format, and in vitro characterization and functional evaluation of hPSC-derived islets, are included. The complete protocol takes 1 week for initial hPSC expansion followed by ~5 weeks to obtain insulin-producing hPSC islets. Personnel with basic stem cell culture techniques and training in biological assays can reproduce this protocol.

The differentiation of stem cells into islet cells provides an alternative solution to conventional diabetes treatment and disease modeling. We describe a detailed stem cell culture protocol that combines a commercial differentiation kit with a previously validated method to aid in producing insulin-secreting, stem cell-derived islets in a dish.

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

Differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into insulin-secreting beta cells provides material for investigating beta cell function and ...

발생학

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ECL assay is a nonradioactive fluid phase assay for islet autoantibodies with higher sensitivity and specificity than the current 'gold' standard radio-binding assay (RBA). ECL assays can more precisely define the onset of presymptomatic T1D by distinguishing the high-risk, high-affinity autoantibodies from the low-risk, low-affinity autoantibodies generated in RBAs, and conventional enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). The antigen protein used in this ECL assay is labeled with Sulfo-tag and Biotin, respectively. Each ECL autoantibody assay that uses a particular antigen protein needs an optimization step before it can be used for laboratory application. This step is especially vital in determining the requirements for serum acid treatments, concentrations, and ratios of the two different antigens labeled with Sulfo-tag and Biotin. To perform the assay, serum samples are mixed with Sulfo-tag-conjugated and biotinylated capture antigen protein in phosphate buffered solution (PBS), containing 5% Bovine Serum Albumin (BSA). Afterwards, the samples are incubated overnight at 4 &#176;C. The same day, a streptavidin-coated plate is prepared with blocker buffer and incubated overnight at 4 &#176;C. On the second day, wash the streptavidin plate and transfer the serum-antigen mixture onto the plate. Place the plate on the plate shaker, set it at low speed, and incubate at room temperature for 1 h. Subsequently, the plate is washed again, and reader buffer is added. The plate is then counted on the plate reader machine. The results are conveyed through an index, which is generated from internal standard positive and negative control serum samples.

Here, we presented the methods to detect human islet autoantibodies using electrochemiluminescence (ECL) assays. The protocol, used to predict type 1 diabetes, can be expanded upon to detect autoantibodies for other autoimmune diseases.

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

면역학 및 감염병학

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

생물학

Measuring Relative Insulin Secretion using a Co-Secreted Luciferase Surrogate

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, depending on the specific assay. Secreted luciferase assays expedite results and lower the assay cost per sample substantially. Here we present a relatively underused approach to gauge insulin secretory activity from pancreatic &#946; cells by using Gaussia luciferase genetically inserted within the C-peptide. During proteolytic processing of proinsulin, the C-peptide is excised releasing the luciferase within the insulin secretory vesicle where it is co-secreted with insulin. Results can be obtained within minutes after sample collection because of the speed of luciferase assays. A limitation of the assay is that it is a relative measurement of insulin secretion and not an absolute quantitation. However, this protocol is economical, scalable, and can be performed using most standard luminescence plate readers. Analog and digital multichannel pipettes facilitate multiple steps of the assay. Many different experimental variations can be tested simultaneously. Once a focused set of conditions are decided upon, insulin concentrations should be measured directly using antibody-based assays with standard curves to confirm the luciferase assay results.

This protocol describes how to perform rapid low-cost luciferase assays at medium-throughput using an insulin-linked Gaussia luciferase as a proxy for insulin secretion from beta cells. The assay can be performed with most luminescence plate readers and multichannel pipettes.

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

Performing antibody-based assays for secreted insulin post-sample collection usually requires a few hours to a day of assay time and can be expensive, ...

Intracellular Signaling Events and Hormone Secretion in Human Pseudoislets(인간 가성섬에서 세포내 신호전달 사건과 호르몬 분비)

Human Pseudoislet System for Synchronous Assessment of Fluorescent Biosensor Dynamics and Hormone Secretory Profiles

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, have a central role in the control of glucose homeostasis through the secretion of insulin by beta cells, which lowers blood glucose, and glucagon by alpha cells, which raises blood glucose. Intracellular signaling pathways, including those mediated by cAMP, are key for regulated alpha and beta cell hormone secretion. The 3D islet structure, while essential for coordinated islet function, presents experimental challenges for mechanistic studies of the intracellular signaling pathways in primary human islet cells. To overcome these challenges and limitations, this protocol describes an integrated live-cell imaging and microfluidic platform using primary human pseudoislets generated from donors without diabetes that resemble native islets in their morphology, composition, and function. These pseudoislets are size-controlled through the dispersion and reaggregation process of primary human islet cells. In the dispersed state, islet cell gene expression can be manipulated; for example, biosensors such as the genetically encoded cAMP biosensor, cADDis, can be introduced. Once formed, pseudoislets expressing a genetically encoded biosensor, in combination with confocal microscopy and a microperifusion platform, allow for the synchronous assessment of fluorescent biosensor dynamics and alpha and beta cell hormone secretory profiles to provide more insight into cellular processes and function.

저자 스포트라이트: Investigating Islet Abnormalities and Function with a Pseudoislet Protocol (유사섬 프로토콜로 섬 이상 및 기능 조사) 

This protocol describes a method for the synchronous acquisition and co-registration of intracellular signaling events and the secretion of insulin and glucagon by primary human pseudoislets using the adenoviral delivery of a cyclic adenosine monophosphate (cAMP) biosensor, a cAMP difference detector in situ (cADDis), and a microperifusion system.

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

The pancreatic islets of Langerhans, which are small 3D collections of specialized endocrine and supporting cells interspersed throughout the pancreas, ...

균질 시간 해결 포스터 공명 에너지 전송 기반 분석 결과 인슐린 분 비의 검출에 대 한

요약

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휴대용 FRET 분석과 고감도 및 고속 형광 검출

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

인간 만능 줄기세포를 인슐린 생산 섬 클러스터로 분화(Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Insulin-producing Islet Clusters)

인간의 섬 신경에 대 한 Electrochemiluminescence 분석 실험

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

공동 분비 된 루시퍼라제 대리를 사용하여 상대 인슐린 분비 측정

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템

형광 바이오센서 역학 및 호르몬 분비 프로파일의 동기 평가를 위한 인간 유사섬 시스템