يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان الدم الليمفاوي المزمن، مثل التشخيص الدقيق للمرضى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة وسريعة ودقيقة للغاية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو التكهن القوي ، وعلى الأخص شهادات المخاطر مع المرضى الذين يعانون من سرطان الدم الليمفاوي المزمن لأن التكهن الدقيق قد يحدد لاحقًا الإدارة العلاجية للمرض.
العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية، مثل تحديد منتج PCR و أنواع تحليل التسلسل الهضمي يصعب تعلمها لأنها تتطلب الدقة والخبرة. لبدء هذا الإجراء، إضافة 200 ميكرولترات من EDTA إلى أنبوب جمع معقم 50 ملليلتر. إضافة 20 ملليلتر من الدم المحيطي و 15 ملليلتر من 15 ملم من دورة في الدقيقة المتوسطة إلى أنبوب وماصة صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات لخلط.
بعد ذلك، إضافة 15 ملليلتر من متوسطة التدرج كثافة إلى أنبوب جمع 50 ملليلتر جديدة. طبقة ببطء حل الدم المحيطي على متوسط التدرج الكثافة، والتأكد من أنه لا يعطل التدرج. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G لمدة 20 دقيقة مع الفرامل الطرد المركزي قبالة.
ثم استخدم ماصة باستور العقيمة لجمع حلقة الخلية أحادية النواة التي تشكلت بين طبقة الصفائح الدموية البلازما العليا وطبقة متوسطة متدرجة الكثافة ونقلها إلى أنبوب جمع جديد معقم 15 ملليلتر. إضافة متوسطة RPMI بحيث يكون حجم النهائي هو 12 ملليلتر وماصة الحل صعودا وهبوطا لخلط. جهاز طرد مركزي في 800 مرة G لمدة ثماني دقائق.
تجاهل افراط وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 10 ملليلتر من متوسطة RPMI. جهاز طرد مركزي مرة أخرى في 750 مرة G لمدة ثماني دقائق. بعد هذا، تجاهل افراة وحل بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني.
باستخدام لوحة باور جديدة، تشكيل عدد الخلايا عن طريق خلط 20 ميكرولترات من العينة و 80 ميكرولترات من واحد إلى 10 حل الترك. وإذا لم يتم جدولة معالجة العينة في نفس اليوم، فإن الطرد المركزي العينة بمعدل 750 مرة من G لمدة ثماني دقائق. تجاهل المابير وتخزين بيليه الخلية في ناقص 80 درجة مئوية.
أولاً، إعداد المزيج التمهيدي باستخدام كميات متساوية من كل التمهيدي المجموعة الفرعية لضمان تضخيم غير متحيزة. امزج الكواشف PCR كما هو موضح في الجدول الثاني من بروتوكول النص. إضافة 0.5 ميكرولتررس من البوليميراز TAP إلى أنبوب PCR تحتوي على الكواشف PCR مختلطة.
ثم، إضافة إما 100 نانوغرام من gDNA أو اثنين من ميكرولترات من cDNA. تشغيل بروتوكول PCR الحرارية كما هو مفصل في الجدول الثالث من بروتوكول النص. بعد ذلك، تحقق من منتجات PCR من أزواج قاعدة 500 تقريبا عند استخدام التمهيدي لتر IGHV أو 350 أزواج قاعدة عند استخدام يمزج التمهيدي IGHPFR1.
لبدء تنقية المنتج PCR، تحميل الحجم الإجمالي للمنتج PCR على هلام agarose منخفضة ذوبان ثلاثة في المئة. السماح للمنتجات PCR لتشغيل على هلام حتى أنها منفصلة عن الخلفية. استخراج عصابات PCR بارزة حادة ومن ثم تنقية و elute لهم.
إذا تم الكشف عن إعادة ترتيب اثنين، يجب أن يتم استئصال كلا النطاقين وتسلسلهما بشكل منفصل. لتنفيذ تنظيف exo-sap، اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالأحجام المحددة التي سيتم استخدامها. دوامة بلطف كل عينة لخلط واحتضان لهم على كتلة PCR في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
تعطيل الانزيمات عن طريق تسخينها إلى 85 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، تحميل كمية صغيرة من منتجات PCR على هلام agarose ثلاثة في المئة لتقييم نقاء المنتج. آخر نقطة تفتيش قبل التسلسل هو تحديد التخفي للعينة باستخدام تحليل الشظايا.
لبدء تحليل التسلسل، ابدأ تشغيل البرنامج المناسب. حدد الأنواع، مثل الإنسان العاقل، ونوع المستقبلات أو المكان. قم بتسريع التسلسلات التي سيتم تحليلها بتنسيق fasta وتضمينها المعرفات في ناحية النص على دفعات تصل إلى 50 تسلسلًا لكل تشغيل.
ثم اختر أحد خيارات العرض الثلاثة التالية للنتائج. عرض مفصل: اختر هذا الخيار من أجل الحصول على النتائج لكل تسلسل على حدة. عرض توليفي:اختر هذا الخيار لتجميع جدول ملخص مرتبة بواسطة الجين IGHV واسم آليل أو حسب ترتيب إدخال التسلسل.
يوفر هذا الخيار أيضًا محاذاة التسلسلات التي يتم تعيينها في أي دفعة تم إرسالها إلى نفس الجين IGHV و allele، وأخيراً، ملف Excel. اختر هذا الخيار لتوفير كافة ملفات الإخراج كجداول بيانات مدمجة في ملف واحد. فقط استخدام التمهيدي لتر IGHV تمكن من تضخيم كامل طول IGHV إعادة ترتيبها، مما يسمح بتحميل HSM الحقيقي لتحديد.
المنتج PCR المتوقع هو أزواج قاعدة 500 تقريباً. في حالات نادرة حيث IGHV لتر التمهيدي لا يمكن تضخيم إعادة ترتيب IG clonotypic، يمكن استخدام التمهيديات IGHBFR1. المنتج PCR المتوقع هو أزواج قاعدة 350 تقريباً.
ثم يتم تحليل التسلسلات التي تم الحصول عليها باستخدام أداة IMG TV Quest. يوضح الصف الأول في جدول النتائج وظيفة التسلسل، حيث يمكن أن يكون تسلسل IG الذي تم إعادة ترتيبه إما منتجًا أو غير منتج. إعادة ترتيب جين IGH غير منتجة هو توقف codons موجودة داخل منطقة VDJ و / أو إذا كان إعادة الترتيب خارج الإطار بسبب عمليات الإدراج / الحذف.
ومن المهم ملاحظة أنه ينبغي إجراء مزيد من التحليل فقط على عمليات إعادة الترتيب الإنتاجية وبالتالي الوظيفية. عند استخدام الافتراضي IMG TV كويست المعلمات، لا يتم الكشف عن الإدراجات والحذف تلقائيا، ولكن المؤشرات القوية التي قد تحمل تسلسل هذه التعديلات يتم توفيرها من قبل الأداة، ويظهر تنبيه تحذير أسفل الجدول ملخص النتيجة. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن الأرض منتجات PCR على هلام طويلة بما فيه الكفاية بحيث يمكن تمييز السندات التخفي من خلفية polyclonal.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة المناعية لسرطان الدم الليمفاوي المزمن لاستكشاف التأثير التنبؤي لحالة التبدل الجسدي في المرضى. لا تنس أن العمل مع بروميد اليثيوم يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل العمل تحت غطاء محرك السيارة في جميع الأوقات دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
