이 방법은 환자의 정확한 예후와 같은 만성 림프구성 백혈병 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 빠르며 매우 정확하다는 것입니다. 이 기술의 의미는 정확한 예후가 나중에 질병의 치료 관리를 정의할 수 있기 때문에, 만성 림프구성 백혈병을 가진 환자를 가진 강력한 예후, 특히 위험한 인증으로 확장합니다.
이 방법의 시각적 데모는 PCR 제품 선택 및 소화 시퀀스 분석 유형과 같이 정밀도와 경험이 모두 필요하기 때문에 배우기 가 어렵습니다. 이 절차를 시작하려면 EDTA 200 마이크로리터를 50 밀리리터 멸균 수집 튜브에 추가합니다. 말초 혈액 20 밀리리터와 15 밀리리터의 RPMI 배지를 튜브에 넣고 파이펫을 2~3회 위아래로 섞습니다.
다음으로, 새로운 50 밀리리터 수집 튜브에 밀도 그라데이션 배지 15 밀리리터를 추가합니다. 말초 혈액 용액을 밀도 그라데이션 배지에 천천히 겹쳐서 그라데이션을 방해하지 않도록 합니다. 원심분리기는 20분 동안 800회 G로 원심분리기 브레이크를 해제합니다.
그런 다음 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상부 플라즈마 혈소판 층과 밀도 그라데이션 중간 층 사이에 형성된 단일 핵 세포 고리를 수집하고 새로운 멸균 15 밀리리터 수집 튜브로 옮김합니다. 최종 볼륨이 12 밀리리터이고 파이펫이 혼합하도록 위아래로 파이펫이 될 수 있도록 RPMI 매체를 추가합니다. 8분 동안 800배 G의 원심분리기.
상체를 버리고 RPMI 배지의 10 밀리리터로 셀 펠릿을 다시 중단하십시오. 원심분리기는 8분 동안 750배 G로 다시 합니다. 그 후, 상체를 버리고 PBS의 1 밀리리터에 세포 펠릿을 용해.
새로운 바우어 플레이트를 사용하여 20 마이크로리터의 샘플과 1~10개의 Turk 용액의 80마이크로리터를 혼합하여 세포 수를 형성합니다. 샘플의 다운스트림 처리가 당일 예약되지 않은 경우 샘플을 8분 동안 750회 G로 원심분리합니다. 상체를 버리고 셀 펠릿을 영하 80도에 보관하십시오.
먼저, 각 하위그룹 프라이머의 평수량을 사용하여 프라이머 믹스를 준비하여 편견없는 증폭을 보장한다. 텍스트 프로토콜의 표 2에 나열된 PCR 시약을 혼합합니다. 혼합 PCR 시약을 포함하는 PCR 튜브에 TAP 폴리머라제 0.5 마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 100 나노그램의 gDNA 또는 2개의 마이크로리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜의 표 3에 상세한 대로 열 PCR 프로토콜을 실행합니다. 그 후 IGHPFR1 프라이머 믹스를 사용할 때 IGHV 리터 프라이머 또는 350개의 기본 쌍을 사용할 때 약 500개의 기본 쌍의 PCR 제품을 확인하십시오.
PCR 제품 정화를 시작하려면 PCR 제품의 총 부피를 3% 저용 아가로즈 젤에 적재합니다. PCR 제품이 배경과 분리될 때까지 젤에서 실행되도록 합니다. 날카로운 눈에 띄는 PCR 밴드를 소비한 다음 정화하고 용인합니다.
두 개의 재배열이 감지되면 두 대역모두 별도로 절제되고 시퀀싱되어야 합니다. 엑소 수액 정리를 수행하려면 사용할 특정 볼륨에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 각 샘플을 부드럽게 소용돌이쳐 30분 동안 PCR 블록에 섞고 배양합니다.
효소를 섭씨 85도까지 15분간 가열하여 비활성화합니다. 그 후, 제품의 순도를 평가하기 위해 3% 아가로즈 젤에 소량의 PCR 제품을 적재한다. 시퀀싱 전에 마지막 검사점은 단편 분석을 사용하여 샘플의 복제도를 결정하는 것입니다.
시퀀스 분석을 시작하려면 적절한 소프트웨어를 시작합니다. 호모 사피엔스와 같은 종및 수용체 유형 또는 궤적을 지정한다. fasta 형식으로 분석할 시퀀스를 최대 50회 시퀀스를 일괄적으로 텍스트 영역에 포함시킵니다.
그런 다음 결과에 대한 다음 세 가지 표시 옵션 중 하나를 선택합니다. 자세한 보기:각 시퀀스에 대한 결과를 개별적으로 얻으려면 이 옵션을 선택합니다. 합성 보기:IGHV 유전자및 allele 이름 또는 서열 입력 순서로 정렬된 요약 테이블을 컴파일하려면 이 옵션을 선택합니다.
이 옵션은 또한 제출된 배치에서 동일한 IGHV 유전자 및 allele에 할당되고 마지막으로 Excel 파일에 할당되는 서열의 정렬을 제공합니다. 이 옵션을 선택하여 모든 출력 파일을 단일 파일에 통합된 스프레드시트로 제공합니다. IGHV 리터 프라이머만 사용하면 재배치된 IGHV의 전체 길이가 증폭되어 실제 HSM 부하가 결정될 수 있습니다.
예상 PCR 제품은 약 500개의 기본 쌍입니다. IGHV 리터 프라이머가 CLONOTYPIC IG 재배열을 증폭할 수 없는 드문 경우는 IGHBFR1 프라이머가 사용될 수 있습니다. 예상 PCR 제품은 약 350개의 기본 쌍입니다.
그런 다음 획득한 시퀀스는 IMG TV 퀘스트 도구를 사용하여 분석됩니다. 결과 테이블의 첫 번째 행에는 IG 재배열 시퀀스가 생산적이거나 비생산적일 수 있기 때문에 시퀀스의 기능이 표시됩니다. IGH 유전자 재배열은 VDJ 영역 내에 있는 코돈이 정지되는 중지 및/또는 삽입/삭제로 인해 재조정이 프레임이 없는 경우입니다.
생산적이고 따라서 기능적인 재배열만 더 분석해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 기본 IMG TV 퀘스트 매개 변수를 사용하는 경우 삽입 및 삭제가 자동으로 감지되지는 하지만 이러한 변경 내용을 수행할 수 있다는 강력한 징후가 도구에 의해 제공되며 결과 요약 테이블 아래에 경고 경고가 나타납니다. 이 절차를 시도할 때, 클론 결합이 다클론 배경에서 구별될 수 있도록 젤에 PCR 제품을 충분히 착륙시키는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
개발 후, 이 기술은 만성 림프구성 백혈병 면역 유전학 분야의 연구자들이 환자의 체증 상순 상태의 예후 적 영향을 탐구하는 길을 열었습니다. 에틸륨 브로마이드로 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 항상 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.
