慢性淋巴细胞白血病免疫球蛋白基因序列分析: 从患者材料到序列解释

该方法有助于回答慢性淋巴细胞白血病领域关键问题，如患者的准确预后。这种技术的主要优点是简单、快速、准确。该技术的影响延伸到强大的预后，尤其是对慢性淋巴细胞白血病患者的风险认证，因为准确的预测可能稍后定义该疾病的治疗管理。

此方法的可视化演示至关重要，例如 PCR 产品选择和消化序列分析类型很难学习，因为它们需要精度和经验。要开始此过程，请将 200 微升 EDTA 添加到 50 毫升无菌收集管中。将20毫升外周血和15毫升RPMI介质加入管子，上下移液器上下混合2至3次。

接下来，将15毫升的密度梯度介质添加到新的50毫升收集管中。缓慢地将外周血溶液分层到密度梯度介质上，确保它不会破坏梯度。在离心机制动器关闭时，以 800 倍 G 离心 20 分钟。

然后使用无菌巴斯德移液器收集在上血浆血小板层和密度梯度介质层之间形成的单核细胞环，并转移到新的无菌15毫升收集管。添加 RPMI 介质，使最终体积为 12 毫升，并上下移液器混合。在800倍G下离心8分钟。

丢弃上一提液，用 10 毫升 RPMI 介质重新悬浮细胞颗粒。再次以 750 倍 G 离心，8 分钟。在此之后，丢弃上经剂，将细胞颗粒溶解在一毫升PBS中。

使用新的鲍尔板，通过混合20微升样品和80微升1至10土耳其溶液，形成细胞计数。如果样品的下游处理未安排在同一天，则将样品以750倍G离心8分钟。丢弃上一液，将细胞颗粒储存在零下80摄氏度。

首先，使用每个子组底转的等量准备底转组合，以确保无偏放大。混合文本协议表二中列出的 PCR 试剂。将0.5微升TAP聚合酶加入含有混合PCR试剂的PCR管。

然后，添加100纳米的gDNA或两微升的cDNA。运行热PCR协议，详见文本协议表三。在此之后，使用 IGHV 升底数或使用 IGHPFR1 底流混合时，检查大约 500 个基对的 PCR 产品或 350 个基对。

要开始 PCR 产品纯化，请将 PCR 产品的总体积加载到 3% 的低熔化气糖凝胶上。允许 PCR 产品在凝胶上运行，直到它们与背景分离。切除尖锐的突出的PCR带，然后净化和除名它们。

如果检测到两个重新排列，则应分别切除两个波段并排序。若要执行外液清理，请按照制造商关于要使用的特定卷的说明进行操作。轻轻涡流每个样品混合和孵育他们在PCR块在37摄氏度30分钟。

将酶加热至85摄氏度15分钟，使酶灭活。在此之后，将少量PCR产品装载到3%的加糖凝胶上，以评估产品的纯度。测序之前的最后一个检查点是使用片段分析确定样本的克隆性。

要开始分析序列，请启动相应的软件。指定物种，如智人，以及受体类型或位点。以快速格式分析的序列，并在每次运行最多 50 个序列的批次中将标识符纳入文本区域。

然后，为结果选择以下三个显示选项之一。详细视图:选择此选项，以便单独获取每个序列的结果。综合视图:选择此选项可编译按IGHV基因和等位基因或序列输入顺序排序的汇总表。

此选项还提供序列的对齐方式，这些序列在任何提交的批处理中都分配给相同的 IGHV 基因和等位基因，最后是 Excel 文件。选择此选项可将所有输出文件作为电子表格合并到单个文件中。只有使用 IGHV 升底片，才能放大重新排列的 IGHV 的完整长度，从而可以确定真正的 HSM 负载。

预期的 PCR 产品大约为 500 个基对。在极少数情况下，IGHV 升底片无法放大克隆性 IG 重新排列，可以使用 IGHBFR1 底像。预期的 PCR 产品约为 350 个基对。

然后使用 IMG 电视任务工具分析获得的序列。结果表中的第一行说明序列的功能，因为 IG 重新排列的序列可以是生产性的，也可以是非生产性的。IGH 基因重排是非生产性的，停止鳕鱼存在于 VDJ 区域和/或如果重新排列由于插入/删除而脱离帧。

需要注意的是，只有生产性的、因此的功能重新排列才应进一步分析。使用默认 IMG TV Quest 参数时，不会自动检测到插入和删除，但该工具会提供序列可能进行此类更改的强烈迹象，结果汇总表下方将显示警告警报。尝试此过程时，重要的是要记住将 PCR 产品放在凝胶上足够长的时间，以便克隆键可以与多克隆背景进行区分。

该技术开发后，为慢性淋巴细胞白血病免疫遗传学领域的研究人员探索体细胞表皮状态对患者体细胞表皮状态的预后影响铺平了道路。不要忘记，使用溴化硅可能极其危险，执行此程序时应始终采取预防措施，例如在发动机罩下工作。