إن دمج هذه المنهجية مع ميكروفليديات صغيرة القائمة على القطرات يساعد على الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بمجال علم المناعة في الأنظمة إلى التغاير الخلوي المشفر والتواصل بين الخلايا المفردة أو مسببات الأمراض. والميزة الرئيسية لهذه التقنية التي قمنا بتطويرها هي أن هذا الإجراء تحميل تلميح يسمح تغليف الخلايا النادرة في قطرات مطابقة عن كثب التوزيع في المئة المتوقعة. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية استخدام نصائح الماصات لتحميل الخلايا إلى قطرات جنسانية واسترداد الخلايا من القطرات.
لتحميل طرف لتوليد قطرات مائي، أولا إضافة ثلاثة ملليلترات من السطح إلى مليلترين من النفط المطحون ورسم خليط مرحلة الزيت في حقنة 2.5 ملليلتر. إزالة أي فقاعات الهواء من الحقنة وتوصيل حقنة إلى قطعة من أنابيب تفلون من طول مناسب. قم بتحميل حقنتين من العينات بزيت معدني مناسب ثنائي التوافق، وتوصيل الحقنة بقطعة ثانية من أنابيب تفلون بطول مناسب.
المقبل، لكمة قطرها خمسة ملليمتر Polydimethylsiloxane أو المكونات PDMS من لوح EDMS الشفاء، ولكمة ثقب ملليمتر واحد من خلال مركز المكونات. أدخل المكونات بإحكام في الطرف العلوي من 200 ميكرولتر ماصة تلميح وإدراج الأنابيب المرفقة مع حقنة النفط المعدنية ثنائي متوافق في المكونات. اِكتِلِ المُضّم المُحقن ببطء لتملأ الماصات بزيت معدني يدفع كل الهواء المتبقي.
ضع بعناية كل من الحقن العينة وحقنة الزيت المطحونة ، على مضخة الحقنة. عندما تم إزالة كل من الهواء، وانخفاض كل ماصة تلميح في حل عينة وpirate حوالي 100 ميكرولترات من عينة الخلية في النصائح. بعد ذلك، أدخل كل من النصائح الماصة للعينة في المداخل الداخلية لرقاقة PDMS وأدخل الأنبوب الذي يحتوي على خليط مرحلة الزيت في المدخل الخارجي.
تعيين معدلات التدفق على مضخة حقنة كما هو مبين وأدخل وتعيين أبعاد كل حقنة. بدء تشغيل المضخة لطرد حل العينة من خلال القنوات الداخلية للجهاز، ومرحلة النفط من خلال القناة الخارجية للجهاز. ثم قم بتوصيل قطعة من أنابيب طول مناسب في منفذ لبدء جمع قطرات عندما تكون مستقرة تشكيل قطرات، وجمع قطرات في أنبوب القفل.
عندما تم جمع جميع قطرات، إضافة 200 ميكرولترات من متوسطة RPMI، دون المصل، على رأس قطرات واحتضان العينة مع ثقب على غطاء أنبوب القفل للفترة الزمنية التجريبية المناسبة. لكسر مستحلب، أولا إضافة ملليلترين من PFO إلى ثمانية ملليلتر من النفط المائل واستخدام حقنة لإزالة النفط الزائد من الجزء السفلي من أنبوب جمع قطرات. ثم إضافة 100 ميكرولترات من 20٪ PFO الحل إلى مستحلب لإطلاق الخلايا مغلفة في مرحلة مائي، والاستفادة من أنبوب لفترة وجيزة لخلط.
لا ننسى أن PFO يمكن أن تكون ضارة للخلايا. وبالتالي، والحفاظ على الاتصال مع PFO إلى أدنى حد ممكن. بعد دقيقة إلى دقيقتين، تدور الحل في أدنى قوة طرد المركزية النسبية الممكنة لمدة 30 ثانية ونقل فورا 550 ميكرولترات من الكسر مائي في أنبوب جديد مقفل يحتوي على 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني الباردة، تستكمل مع 2٪ مصل العجل الجنين، أو FCS.
السماح لأي بالوعة النفط المتبقية إلى الجزء السفلي من أنبوب قفل جديد ونقل بعناية 950 ميكرولترات من الخلية التي تحتوي على مرحلة مائي إلى أنبوب قفل جديد. تأكد من أن النفط لا يتم نقله جنبا إلى جنب مع المرحلة مائي في أنبوب قفل جديد. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 300 microliters من برنامج تلفزيوني الباردة الطازجة تكملها 2٪ FCS.
باستخدام نهج تحميل تلميح كما هو موضح للتو، يمكن الحصول على معدلات تغليف الخلية Jurkat T بالتزامن مع القيم المتوقعة إحصائيا. اللافت للنظر ، حتى مع الخلايا الملتمَكَة مثل الخلايا السرطانية ، التي تميل إلى التكتل ، أو الخلايا النادرة مثل الخلايا التشعبية البلازمية ، يتم ملاحظة كفاءة تغليف محسنة. خلال هذا التغليف التمثيلي ، تجددت القطرات باستخدام درجة حرارة التبلور المنخفضة للغاية agarose وgelled بعد الإنتاج لتشكيل حبات agarose hydrogel التي سمحت بإجراء تحليل لاحق للمصب عبر المجهر والتقم الكيسي.
وكشف التحليل المجهري أن الاقتران الخلوي تم تحقيقه في تركيبات مختلفة إرشادية عالية الإنتاجية الخلية الاقتران وتحليل نفس السكان من الخرز هيدروجيل عن طريق تدفق الخلايا الخلوية، وكشفت أن الخرز دون خلايا يمكن فصلها عن الخرز مع الخلايا مع الخلايا على أساس أنماطها منفصلة إلى الأمام والجانبية مبعثر. في الواقع، أكد البوابات على مجموعة الخرز بدون خلايا عدم وجود تغليف للخلايا بسبب عدم وجود إشارات الفلورسنت بينما كشف البوابات على مجموعة الخرز مع الخلايا عن وجود مجموعات فرعية متعددة تدل على تغليف خلايا جوركات تي التي تحمل علامات مختلفة. أثناء العمل مع هذا الأسلوب، من المهم أن نتذكر أن تركيز الخلايا هو عامل مقيد، ويجب أن يكون الأمثل لضمان كفاءة تغليف الخلية وإقران الخلايا.
بعد هذا الإجراء، لا يمكن تغليف خلية أو خليتين فقط في قطرات ذات كفاءة عالية، ولكن يمكن تغليف خلايا متعددة، أو أنواع الخلايا، لتكرار أكثر دقة للبيئة الدقيقة الخلوية. هذه التقنية سوف تمهد الطريق للباحثين في مجالات علم المناعة والتخصصات ذات الصلة للاستخدام الأمثل من مجموعات الخلايا ندبة والتغليف كفاءة في قطرات، لدراسة السلوك الخلوي في بيئة خالية من الضوضاء.
