この方法論を液滴ベースのマイクロ流体と統合することは、細胞の異質性と単一の細胞または病原体間のコミュニケーションをコード化するために、システム免疫学の分野に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。我々が開発したこの技術の主な利点は、この先端の負荷手順は、予測されたパーセント分布と密接に一致する液滴中の希少細胞のカプセル化を可能にすることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、ピペットチップを使用して細胞をジェンダー液滴にロードし、液滴から細胞を取り出す方法を理解するために重要です。
水液滴生成のためのチップローディングのために、最初に2ミリリットルの小麦粉油に界面活性剤を3ミリリットル加え、油相混合物を2.5ミリリットルのシリンジに引き込みます。シリンジから気泡を取り除き、適切な長さのテフロンチューブの一部に注射器を接続します。適切な2つの互換性のある鉱物油で2つのサンプルシリンジをロードし、適切な長さのテフロンチューブの2番目の部分に注射器を接続します。
次に、硬化したEDMSスラブから直径5ミリメートルのポリジメチルシロキサンまたはPDMSプラグをパンチし、プラグの中央に1ミリメートルの穴を開けます。プラグを200マイクロリットルピペットチップの上端にしっかりと差し込み、互換性のあるミネラルオイルシリンジに取り付けたチューブをプラグに差し込みます。注射器プランジャーをゆっくりと落ち込ませ、ピペットチップに残りの空気をすべて押し出す鉱物油で満たします。
サンプルシリンジと小麦粉のオイルシリンジの両方を注射器ポンプの上に慎重に置きます。すべての空気が取り除かれたら、各ピペットチップをサンプル溶液に下げ、約100マイクロリットルの細胞サンプルをチップに吸引します。次に、サンプル含有ピペットチップの両方をPDMSチップの2つの内側の入り口に挿入し、油相混合物を含むチューブを外側の入口に挿入する。
指示に応じてシリンジポンプの流量を設定し、各シリンジの寸法を入力して設定します。ポンプを起動して、デバイスの内部チャネルを通してサンプル溶液をフラッシュし、デバイスの外側のチャネルを通して油相を流します。次に、適切な長さのチューブを出口に差し込み、液滴形成が安定しているときに液滴の収集を開始し、ロックチューブに液滴を集める。
すべての液滴が採取されたら、200マイクロリットルのRPMI培地を加え、血清を含まず液滴の上に、適切な実験期間のためにロックチューブの蓋の穴でサンプルをインキュベートする。エマルジョン破断の場合は、まず8ミリリットルの油に2ミリリットルのPFOを加え、注射器を使用して液滴採取管の底から余分な油を取り除きます。次に、20%PFO溶液の100マイクロリットルをエマルジョンに加え、封入した細胞を水相に放出し、チューブを短時間タップして混合します。
PFOは細胞に有害である可能性があることを忘れないでください。したがって、PFO との接触を最小限に抑えてください。1〜2分後、溶液を可能な限り低い相対遠心力で30秒間回転させ、500マイクロリットルの冷たいPBSを含む新しいロックチューブに水分率の550マイクロリットルを直ちに移し、2%の胎児子牛血清、またはFCSを補う。
任意の残留油を新しいロックチューブの底に沈め、水相を含むセルの950マイクロリットルを新しいロックチューブに慎重に移します。新しいロックチューブに水相と一緒にオイルが転送されないことを確認してください。次いで遠心分離により細胞を回収し、2%FCSを補充した新鮮な冷たいPBSの300マイクロリットルでペレットを再懸濁する。
ちょうど示したように、先端の積み込みアプローチを使用して、ジュルカットT細胞カプセル化率は統計的に予測された値と一致する得ることができる。驚くべきことに、腫瘍細胞のような付着細胞であっても、凝集する傾向がある、または血漿細胞性樹状細胞のような稀な細胞は、改善された封入効率が観察される。この代表的なカプセル化の間に、超低ゲル化温度アガロースを使用して再生し、生成後にゲル化した液滴は、顕微鏡およびフローサイトメトリーを介してその後の下流分析を可能にするアガロースヒドロゲルビーズを形成した。
顕微鏡分析の結果、フローサイトメトリーによるヒドロゲルビーズの同じ集団の異なる組み合わせとヒドロゲルビーズの分析を示す異なる組み合わせで細胞の組み合わせが達成されたことを明らかにし、細胞のないビーズは、その異なる前方および横方向の散乱パターンに基づいて細胞とビーズと分離できることを明らかにした。実際、細胞のないビーズの集団に対する格言は、細胞を有するビーズ集団に対する格言をしながら蛍光シグナルがないことによって細胞カプセル化の欠如を確認し、異なる標識を有するJurkat T細胞のカプセル化を示す複数の亜集団の存在を明らかにした。この方法を使用する際には、細胞濃度が制限因子であり、効率的な細胞カプセル化と細胞ペアリングを保証するために最適化する必要があることを覚えておくことが重要です。
この手順に従うと、1つまたは2つの細胞を高効率の液滴にカプセル化できるだけでなく、複数の細胞、または細胞タイプをカプセル化して、細胞マイクロ環境のより正確な複製を行うことができる。この技術は、免疫学の分野および関連分野の研究者が、瘢痕細胞集団の最適な利用と液滴中での効率的なカプセル化を行い、ノイズのない環境で細胞行動を研究する道を開く。
