La integración de esta metodología con microfluídicos basados en gotas ayuda a responder preguntas clave relacionadas con el campo de la inmunología de sistemas para codificar la heterogeneidad celular y la comunicación entre células individuales o patógenos. La principal ventaja de esta técnica que desarrollamos es que este procedimiento de carga de puntas permite la encapsulación de células raras en gotas que coinciden estrechamente con el porcentaje de distribución previsto. La demostración visual de este método es fundamental para comprender cómo utilizar las puntas de pipeta para cargar celdas en gotas de género y para recuperar celdas de las gotas.
Para la carga de puntas para la generación de gotas acuosas, primero agregue tres mililitros de tensioactivo a dos mililitros de aceite harineado y extraiga la mezcla de fase de aceite en una jeringa de 2,5 mililitros. Retire las burbujas de aire de la jeringa y conecte la jeringa a un trozo de tubo de teflón de una longitud adecuada. Cargue dos jeringas de muestra con un aceite mineral compatible con nosotros y conecte la jeringa a una segunda pieza de tubo de teflón de una longitud adecuada.
A continuación, perforar un enchufe de cinco milímetros de diámetro de Polidimetilsiloxano o PDMS desde una losa EDMS curada y perforar un agujero de un milímetro a través del centro del enchufe. Inserte el enchufe firmemente en el extremo superior de una punta de pipeta de 200 microlitrotros e inserte el tubo unido a la jeringa de aceite mineral compatible en el enchufe. Presione lentamente el émbolo de la jeringa para llenar la punta de la pipeta con aceite mineral expulsando todo el aire residual.
Coloque cuidadosamente las jeringas de muestra y la jeringa de aceite harineado en una bomba de jeringa. Cuando se haya eliminado todo el aire, baje cada punta de pipeta en la solución de muestra y aspire alrededor de 100 microlitros de muestra de célula en las puntas. A continuación, inserte las dos puntas de pipeta que contienen muestras en las dos entradas internas del chip PDMS e inserte el tubo que contiene la mezcla de fase de aceite en la entrada externa.
Ajuste los caudales en la bomba de la jeringa como se indica y entre y ajuste las dimensiones de cada jeringa. Encienda la bomba para vaciar la solución de muestra a través de los canales internos del dispositivo y la fase de aceite a través del canal exterior del dispositivo. A continuación, enchufe un trozo de tubo de una longitud adecuada en la salida para comenzar a recoger las gotas cuando la formación de gotas es estable, recogiendo las gotas en un tubo de bloqueo.
Una vez recogidas todas las gotas, añadir 200 microlitros de RPMI medio, sin suero, encima de las gotas e incubar la muestra con el orificio en la tapa del tubo de bloqueo durante el período de tiempo experimental adecuado. Para romper la emulsión, primero agregue dos mililitros de PFO a ocho mililitros de aceite flouinado y utilice una jeringa para eliminar el exceso de aceite de la parte inferior del tubo de recolección de gotas. A continuación, agregue 100 microlitros de 20%solución de PFO a la emulsión para liberar las células encapsuladas en la fase acuosa, y toque el tubo brevemente para mezclar.
No olvide que el PFO puede ser perjudicial para las células. Y por lo tanto, mantenga el contacto con PFO al mínimo. Después de uno a dos minutos, gire la solución a la menor fuerza centrífuga relativa posible durante 30 segundos e transfiera inmediatamente 550 microlitros de la fracción acuosa a un nuevo tubo bloqueado que contenga 500 microlitros de PBS frío, complementado con 2%Fetal Calf Serum, o FCS.
Deje que cualquier disipador de aceite residual al fondo del nuevo tubo de bloqueo y transfiera cuidadosamente 950 microlitros de la célula que contiene la fase acuosa a un nuevo tubo de bloqueo. Asegúrese de que el aceite no se transfiere junto con la fase acuosa en el nuevo tubo de bloqueo. Luego recoger las células por centrifugación y volver a suspender el pellet en 300 microlitros de PBS frío fresco complementado con 2%FCS.
Usando el enfoque de carga de puntas como se acaba de demostrar, se pueden obtener las tasas de encapsulación de células T de Jurkat coincidentes con los valores predichos estadísticamente. Sorprendentemente, incluso con células adherentes como las células tumorales, que tienden a aglutillarse, o células raras como células dendríticas plasocitosicas, se observa una mayor eficiencia de encapsulación. Durante esta encapsulación representativa, las gotas se regeneraron utilizando agarosa de temperatura gelificante ultrabaja y gelificadas después de la producción para formar perlas de hidrogel de agarosa que permitieron el posterior análisis aguas abajo a través de microscopía y citometría de flujo.
El análisis microscópico reveló que el emparejamiento celular se logró en diferentes combinaciones indicativas de emparejamiento celular de alto rendimiento y análisis de la misma población de cuentas de hidrogel por citometría de flujo, reveló que las cuentas sin células podían separarse de las perlas con células basadas en sus distintos patrones de dispersión hacia adelante y hacia un lado. De hecho, el gating en la población de cuentas sin células confirmó una falta de encapsulación celular por la ausencia de señales fluorescentes mientras que gating en la población de cuentas con células reveló la existencia de múltiples sub-poblaciones indicativas de la encapsulación de células T de Jurkat etiquetadas de manera diferente. Mientras se trabaja con este método, es importante recordar que la concentración celular es un factor limitante y debe optimizarse para asegurar la encapsulación eficiente de celdas y el emparejamiento de celdas.
Siguiendo este procedimiento, no sólo se pueden encapsular una o dos células en gotas con alta eficiencia, sino que se pueden encapsular varias celdas, o tipos de celdas, para una replicación más precisa del entorno micro celular. Esta técnica allanará el camino para que los investigadores en los campos de la inmunología y las disciplinas relacionadas para la utilización óptima de las poblaciones de células de cicatrices y su encapsulación eficiente en gotas, estudien el comportamiento celular en un entorno libre de ruido.
