Интеграция этой методологии с микрофлюиды на основе капель помогает ответить на ключевые вопросы, связанные с областью системной иммунологии для кодирования клеточной неоднородности и связи между одиночными клетками или патогенами. Основным преимуществом этого метода, который мы разработали, является то, что эта процедура загрузки наконечника позволяет инкапсуляцию редких клеток в каплях, близко соответствующих прогнозируемому распределению процентов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для понимания того, как использовать пипетки советы для загрузки клеток для гендерных капель и для получения клеток из капель.
Для погрузочной нагрузки для аквеозного производства капель сначала добавьте три миллилитров сурфактанта в два миллилитров мучного масла и нарисуйте смесь фазы масла в шприц 2,5 миллилитров. Снимите пузырьки воздуха со шприца и соедините шприц с куском тефлоновой трубки соответствующей длины. Загрузите два образца шприцев соответствующим бисовместимым минеральным маслом и соедините шприц со вторым куском тефлоновой трубки соответствующей длины.
Затем пробить пятимиллиметровый диаметр полидиметилсилоксана или PDMS штепсельную вилку из вылеченной плиты EDMS и пробить одно миллиметровое отверстие через центр вилки. Вставьте вилку плотно в верхнем конце 200 микролитер пипетки-наконечник и вставить трубки прилагается к би-совместимый шприц минерального масла в штепсельную вилку. Депрессия шприц поршень медленно, чтобы заполнить пипетку-наконечник с минеральным маслом выталкивая весь остаточный воздух.
Тщательно поместите оба образца шприцев и flourinated шприц масла, на шприц насос. Когда весь воздух был удален, опустите каждый пипетку-наконечник в образец раствора и аспирировать около 100 микролитров образца клеток в кончики. Затем вставьте оба образца, содержащих пипетки-советы в два внутренних входов чипа PDMS и вставьте трубку, содержащую смесь фазы масла, во внешнюю входную часть.
Установите скорость потока на шприц насоса, как указано и введите и установить размеры каждого шприца. Запустите насос, чтобы промыть образец раствора через внутренние каналы устройства, и масляной фазы через внешний канал устройства. Затем подключите кусок трубки соответствующей длины в розетку, чтобы начать сбор капель, когда образование капель стабильной, собирая капли в трубке замка.
Когда все капли были собраны, добавьте 200 микролитров RPMI среды, без сыворотки, поверх капель и инкубировать образец с отверстием на крышке трубки замка для соответствующего экспериментального периода времени. Для разрыва эмульсии, сначала добавьте два миллилитров PFO до восьми миллилитров из flouinated масла и использовать шприц, чтобы удалить избыток масла со дна трубки сбора капель. Затем добавьте 100 микролитров 20%PFO раствор для эмульсии, чтобы освободить инкапсулированные клетки в aqueous фазы, и нажмите трубку кратко перемешать.
Не забывайте, что PFO может быть вредным для клеток. И поэтому свяжу контакт с ПФО до минимума. После одной-двух минут, спина раствор на минимально возможной относительной центробежной силы в течение 30 секунд и немедленно передать 550 микролитров аквеальной фракции в новую запертую трубку, содержащую 500 микролитров холодного PBS, дополненный 2%Fetal calf Serum, или FCS.
Пусть любое остаточное масло опустится на дно новой трубки замка и тщательно перенесите 950 микролитров ячейки, содержащую aqueous фазу, в новую трубку замка. Убедитесь, что масло не передается вместе с aqueous фазы в новую трубку блокировки. Затем соберите клетки путем центрифугации и повторно приостанавливайте гранулы в 300 микролитров свежего холодного PBS, дополненного 2%FCS.
Используя подход загрузки наконечников, как только что продемонстрировано, можно получить скорость инкапсуляции клеток Jurkat T, совпадая со статистически прогнозируемыми значениями. Примечательно, что даже с адептом клеток, таких как опухолевые клетки, которые, как правило, слипаются, или редкие клетки, такие как плазмоцитоидные дендритные клетки, наблюдается улучшенная эффективность инкапсуляции. Во время этой репрезентативной инкапсуляции капли регенерировали с помощью сверхнизкой гелеобразной температуры агарозы и гелеобразов после производства, чтобы сформировать агарозные гидрогельные бусины, что позволило последующему анализу вниз по течению с помощью микроскопии и цитометрии потока.
Микроскопический анализ показал, что спаривание клеток было достигнуто в различных комбинациях, указывающих на высокую пропускную способность клеточного спаривания и анализа одной и той же популяции гидрогелевых бусин по цитометрии потока, показали, что бусы без клеток могут быть отделены от бисера с клетками на основе их различных моделей рассеяния вперед и сбоку. Действительно, gating на популяцию бисера без клеток подтвердил отсутствие инкапсуляции клеток из-за отсутствия флуоресцентных сигналов в то время как gating на популяции бисера с клетками показали существование нескольких суб-популяций свидетельствует об инкапсуляции по-разному помечены Jurkat Т-клеток. Во время работы с этим методом, важно помнить, что концентрация клеток является ограничивающим фактором, и должны быть оптимизированы для обеспечения эффективной инкапсуляции клеток и спаривания клеток.
После этой процедуры, не только может быть инкапсулирована одна или две клетки в каплях с высокой эффективностью, но несколько клеток, или типов клеток, могут быть инкапсулированы для более точной репликации клеточной микро-среды. Этот метод проложит путь для исследователей в области иммунологии и смежных дисциплин для оптимального использования популяций рубцовых клеток и их эффективной инкапсуляции в каплях, для изучения клеточного поведения в бесшумной среде.
