أشكر لك Miyashiro كيفن لطلاء والحفاظ على الثقافات الخلية ، للدكتور تيري Schochet لتوفير الثقافات خلية للصور المدرجة في هذه الوثيقة. بالإضافة إلى ذلك ، أشكر لك Miyashiro كيفن ، والدكتور بيتر باكلي ، وPertiz تينا للحصول على مدخلات بشأن الإجراء آرنا. تم تمويل هذا العمل من المعهد الوطني للشيخوخة ، والمعهد الوطني للصحة النفسية والباحث عن الحقيقة الأموال الموارد البشرية من رابطة ولاية بنسلفانيا.

<ol>
	<li>Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+considerations+regarding+single-cell+gene+expression+profiling+for+brain+injury.">Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury.</a> Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).</li><li>Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+molecular+biology.">Single-cell molecular biology.</a> Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).</li><li>Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microarray+analysis+in+hippocampus+CA1:+Demonstration+and+Validation+of+Cellular+Heterogeneity.">Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity.</a> The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).</li><li>Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+neurons+as+experimental+systems+in+molecular+biology.">Single neurons as experimental systems in molecular biology.</a> Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).</li><li>Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+gene+expression+analysis:+Implications+for+Neurodegenerative+and+Neuropsychiatric+Disorders.">Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders.</a> Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).</li><li>Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+DNA+synthesis+in+situ:+methods+and+applications.">Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications.</a> Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).</li><li>Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons.">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).</li><li>Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+antisense+RNA+amplification+and+microarray+analysis+as+a+tool+for+studying+neurological+degeneration+and+restoration.">Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration.</a> Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).</li><li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126, 397-425 (1977).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-1000 &#38; P-97 Pipette Cookbook. , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Megascript kit. , 7-8 .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MEGAclear kit. , 4-5 .</li><li>Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+expression+analysis+of+tissue+sections+and+single+cells.">mRNA expression analysis of tissue sections and single cells.</a> The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).</li><li>Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+nature+and+differential+distribution+of+mRNAs+in+hippocampal+neuritis:+Implications+for+neuronal+functioning.">On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).</li><li>Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+transfer+produces+a+predictable+cellular+phenotype.">Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).</li><li>Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+revisited+as+a+tool+for+transcriptomic+analysis:+Application+of+an+excel-based+qPCR+preparation+software+(PREXCEL-Q).">Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q).</a> Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).</li><li>Vandewoestyne, M., Deforce, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+in+forensic+research:+a+review.">Laser capture microdissection in forensic research: a review.</a> Int J Legal Med. 124, (2010).</li><li>Eberwine, J., Bartfai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+of+hypothalamic+warm+sensitive+neurons+that+control+core+body+temperature+and+fever+response+Signaling+asymmetry+and+an+extension+of+chemical+neuroanatomy.">Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy.</a> Pharmacol. Ther. , (2010).</li></ol>

الدكتور Eberwine هو المخترع على براءة اختراع آرنا التي قد تم الترخيص لتكنولوجيات LBS التي الدكتور Eberwine هو صاحب حصة.

ملاحظات وأخطاء <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد ترغب في اتخاذها قبل وبعد عرض الصور التي تم عزل الخلايا المستهدفة والتي تم يمسها في غبش المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان حل الكثير من يدخل ماصة كما كنت الحصاد ، يمكنك استخدام طريقة 3 Luer لوك التجهيزات والمكبس للحقنة لاجراء الضغط الايجابي في الأنابيب. فإن حجم المطلوب تختلف مع نوع من المعالجة ولكن ما يصل إلى 5 ميكرولتر ينبغي أن يكون على ما يرام بالنسبة لمعظم التطبيقات. </li></ul> نصائح عامة حول التقنيات البيولوجية الجزيئية <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة جميع أنابيب الأسهم وتدور عليهم قبل إضافة إلى رد الفعل. NEVER الانزيمات الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ردود الفعل مزيج دقيق قبل إضافة انزيم لضمان أن المخزن هو في التركيز السليم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانزيم في الحفاظ على مخزون -20 درجة مئوية إذا كان ذلك ممكنا باستخدام stratacooler. خلاف ذلك ، وإزالة الحق قبل الاستخدام ، والحفاظ على الجليد ، والعودة فورا إلى -20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمزج دائما الرئيسي عند إعداد أكثر من رد فعل للحد من الأخطاء pipetting. حساب حجم المطلوبة استنادا إلى عدد من العينات وتضيف 10-20 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية إلى تأخير التدهور. الحمض النووي الريبي هو الأكثر استقرارا المخزنة في المخزن المؤقت لapurination تؤخر من الحمض النووي الريبي الذي يحدث في الظروف الحمضية. </li></ul> عام الخطوط العريضة للإجراءات آرنا ويوضح الشكل 4A الجولة الأولى من الإجراء آرنا. في رد فعل حبلا الأول ، الجزء بولي - T من التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة لتحديد الأنواع مرنا (مستطيل أبيض طويل) ملزمة لذيول polyA. ومذيل بعديد الأدينيلات أيضا بعض microRNAs وسوف يتم القبض على هذا الإجراء. الأهم من ذلك ، ومع ذلك ، فإن الرناوات الأكثر وفرة في الخلية ، الرنا الريباسي ، لا. هذه جزئية بمثابة التمهيدي للالناسخ العكسي لتجميع حبلا التكميلية لل[كدنا] (الطويل المستطيل الرمادي) باستخدام مرنا كقالب. الجزء التمهيدي من T7 (DT) T7 - ​​جزئية تتضمن بوليميريز RNA T7 المروج في الإطار مع العقاقير تسلسل مرنا للانطلاق. ويستخدم هذا لاحقا في رد فعل في المختبر النسخ. المقبل ، ومرنا في مرنا الهجين / الحمض النووي التي تم إنشاؤها في الخطوة السابقة محملئا جزئيا H ريبونوكلياز خلق الحمض النووي الريبي &quot;الاشعال&quot; (مستطيلات صغيرة بيضاء) مشابهة إلى شظايا أوكازاكي إنشاؤها في متخلفة حبلا توليف الحمض النووي. البلمرة DNA الأول يستخدم لتجميع شظايا الحمض النووي الريبي DNA الوزراء باستخدام الحمض النووي مكملة لمرنا كقالب. عندما تصل إلى تفتيت الحمض النووي الريبي المقبل ، في 5 &#39;إلى 3&#39; nuclease النشاط يزيل ribonucleotides واستبدالها deoxyribonucleotides. يضاف إلى الحمض النووي يغاز ligate أي فروع فيها استبدال حبلا الرائدة ليست كاملة. يضاف T4 البلمرة DNA لملء في المناطق التي كانت بمثابة شظايا الحمض النووي الريبي الاشعال الأولية لالبلمرة DNA أنا خلق كليلة العضوية المزدوجة [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل التي تتم تنقيته ثم قبل تنفيذ رد فعل IVT. في رد فعل IVT ، T7 بوليميريز RNA بربط المروج T7 دمجها المزدوج تقطعت بهم السبل [كدنا] ويجمع جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير (مستطيلات سوداء طويلة) باستخدام حبلا الشعور كقالب. هذا بمثابة خطوة التضخيم التي تنتج الآلاف من جزيئات الحمض النووي الريبي العقاقير من كل جزيء الذين تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا] (الشكل 4A). الجولة الثانية ، كما هو مبين في الشكل 4B ، ويبدأ مع رد فعل عكس النسخ التي تختلف قليلا عن تلك الجولة الاولى منذ البداية هي العقاقير RNA (مستطيل أسود خالص) ، ويفتقر إلى ذيل مذيل بعديد الأدينيلات أنه كان مستهدفا من قبل T7 - ​​بنسبة ضئيلة (DT) التمهيدي في الجولة الاولى. لذلك ، وتستعد هذا التفاعل مع الاشعال العشوائي (مستطيلات صغيرة رمادية) والحمض النووي الريبي التشويه والتحريف لاحقا. وتستعد ثم رد فعل من جانب الشق الثاني التمهيدي (DT) T7 - ​​بنسبة ضئيلة ، والذي يربط تسلسل بولي في نهاية A - 3 &#39;من الحمض النووي الريبي الشعور إنشاؤها في رد فعل عكس النسخ السابقة. يتم تنفيذ رد فعل آخر IVT بنفس الطريقة كما في الجولة الاولى. وعادة ما يتم تكرار هذه الجولة الثانية على الأقل مرة واحدة لتحقيق ثلاثة جولات من التضخيم من خلية واحدة. تطبيقات يمكن ترجمتها التقنيات التي قدمناها في هذه المقالة إلى عدد كبير من التطبيقات. يمكن تعديل بروتوكول العزلة خلية واحدة لاستخدامها في شرائح حادة. 14 على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية ، وتطبق المبادئ نفسها في إعداد هذا البديل. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تعديلها بشكل طفيف في حجم ماصة ، يمكن إجراء تسجيلات لعلم وظائف الأعضاء من الخلايا قبل الحصاد السماح بإجراء تحقيق جيدا للسيطرة الآليات الجزيئية وراء مخرجات الفسيولوجية. آخر تعديل طفيف هو عزل العمليات سوما من الخلية. 15 لهذا التطبيق ، وجمع الهيئات خلية واحدة ماصة ثم نعود مع ماصة الطازجة وجمع 100-300 dendrit المحددةوفاق أو المحاور في أنبوب جمع (16). بمجرد أن يتم حصاد الخلايا ، ويمكن إجراء مقارنات بين تركيزات مرنا وبين مختلف مكونات وحتى داخل نفس الخلية السكان. دمج biotinylated - UTP آرنا في الجولة الثالثة يسمح للتحليل [ميكروأري لتحديد هذه الكميات المتوفرة مرنا نسبيا. يمكن أيضا أن التركيبة السكانية الأصلية مرنا يتحدد بعد العملية آرنا باستخدام التسلسل التالي جيل. يمكن أيضا أن تستخدم آرنا تضخيم لتأكيد دراسات الخلايا تحويل النمط الظاهري الذي يتم transfected مجموعة كاملة من mRNAs من نوع خلية واحدة إلى نوع من الخلايا المختلفة من أجل إحداث الانتقال من النمط الظاهري من النوع الأخير إلى أن الخلية من السابق ، الإجراء الذي وضعه مختبر والمعروف TIPeR (17). هذه الدراسات مفيدة بشكل خاص لدراسة الحالات المرضية والظواهر الخلية ومثل هذه الدراسات ما زالت جارية في الوقت الراهن في المختبر. لا يمكن أن يؤديها RT - PCR أو qPCR على المواد تضخيم لتأكيد تعبير عن خلية محددة الجينات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء تقييمات لكفاءة ترنسفكأيشن أو تنبيغ على مستوى خلية واحدة. المزايا والقصور كما جاء في الملخص ، والعزلة واحدة من الخلايا لتحليل يلغي الآثار المشاهدة في المتوسط ​​مع تحليل للسكان الخلية غير المتجانسة. هذه الآثار متوسط ​​تركيزات تحريف مرنا داخل خلية واحدة أكثر من النصوص التي تمثل في المتوسط ​​وفيرة والخروج ومنع الكشف عن محاضر منخفضة وفرة كثيرة. يمكن أن تستخدم التدفق الخلوي لفرز الخلايا الفردية ، ولكن هذا الأسلوب يتطلب معرفة علامات معينة الخلايا ومعدات باهظة الثمن. microdissection التقاط 18 ليزر الأشعة فوق البنفسجية سواء مع أو الأشعة تحت الحمراء نظم الليزر microdissection التقاط تسمح للخلية واحدة ، وحتى التقاط التحت خلوية ولكنها تتطلب الخلايا التي تهم أن يكون موجودا على سطح المقاطع رقيقة جدا (19). مماثلة لالتدفق الخلوي ، ليزر microdissection التقاط كما يتطلب معدات باهظة الثمن. واحدة من الفوائد الرئيسية لتقنية جمع الكهربائي القائمة المذكورة أعلاه هو أنه يمكن الحصول على بيانات قيمة الكهربية من خلية من الفائدة قبل الحصاد ، مما يسمح للتحليل وظيفي وtranscriptome التي يتعين القيام بها في الخلية نفسها. 20 A السلبي للتقنية لدينا أنها لا تتطلب خبرة في استخدام micromanipulators. سوف المحققون على دراية micromanipulators تجد هذه التقنية بديهية جدا ، ولكن مع عدم وجود أفراد هذه التجربة سوف تحتاج لتصبح مريحة مع الحركات الدقيقة المطلوبة. المتأصلة في أي أسلوب التضخيم هو تضخيم التفضيلية لبعض النصوص على أساس حجم وتكوين النوكليوتيدات. 4،6،7 تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التقنيات التي تعتمد مثل عكس النسخ بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (RT - PCR) والتضخيم السريع ل[كدنا] تاريخ (العرق) نتيجة التضخيم في الأسي النصوص ، في حين أن تضخيم النتائج آرنا الإجراء في تضخيم الخطية. وهكذا ، واحدة من أهم مزايا هذا الإجراء آرنا يكمن في قدرتها على الحفاظ على أفضل وفرة نسبية من النصوص التي كتبها مرنا فقط تضخيم خطيا أي أخطاء أو التحيزات التي تحدث في عملية التضخيم في مقابل تضخيم الأخطاء بشكل كبير وقال والتحيز. الإجراء آرنا مقرونا تحليل ميكروأري يسمح للمقارنة بين تركيزات مرنا بين الخلايا واحد من التشكل مماثلة أو مختلفة ، معالجة أو غير معالجة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقديم مواد تضخيم لتسلسل الجيل القادم. 5،8 ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر في مثل هذه التحليلات لأنه ، في المقابل الى استخدام بادئات عشوائية لإجراء العملية ، الإجراء بنسبة ضئيلة من DT معبي المذكورة أعلاه التضخيم من التحيزات &quot;3 نهايات مرنا والنتائج عموما في تقصير طفيف في المواد اللاحقة تتضخم مع كل جولة. وينبغي توخي الحذر في تحليل النتائج ميكروأري مع الأساليب القياسية كما تغيب بعض المكالمات كاذبة يمكن أن تنشأ عن تقصير بعض الشيء المادي تضخيمها. بالإضافة إلى ذلك ، في حين تتابع نتائج ستوفر بالفعل 5 كامل قد &#39;تسلسل معظم مرنا الأصلي ، 5&#39; ينبغي تفويتها تسلسل بعض مرنا. لهذه الأسباب ، ينبغي أن يقتصر عدد جولات من التكبير.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/2634/transcriptome-analysis-of-single-cells">Transcriptome Analysis of Single Cells</a>. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section.

Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Spiegelgas coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological</td>
<td>63-3029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nunc 35x10 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-90</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Water for cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-724Q</td>
<td>For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine MW70-150K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>6407</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laminin, ultrapure</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>354239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boric acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B0252</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and glutamax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41090-101</td>
<td>For plating cells</td>
</tr>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8769</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horse serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytosine beta-D-arabinofuranoside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C1768</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MEM with Earle&#x2019;s salts and L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11095-098</td>
<td>For growing cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 serum-free supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimble Chase</td>
<td>34500 99</td>
<td>Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. </td>
</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175</td>
<td>Any solution will work as long as the components won&#x2019;t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)</td>
</tr>
<tr>
<td>1ml syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309628</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gauge depends on the diameter of the pipettes</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>28-4065-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dt-T7 oligo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
<td>Midland Certified</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Second strand buffer (5x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>Y01129</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DTT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Supplied with second strand buffer</td>
</tr>
<tr>
<td>E.coli DNA Ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100002324</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA polymerase I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnase H</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18021-071</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Megascript T7 kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AM1334</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Random primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BMB</td>
<td>11034731001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Superscript III Reverse Transcriptase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>56575</td>
<td>in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT</td>
</tr>
<tr>
<td>MEGAclear Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>1908</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28206</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA polymerase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100004994</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rnasin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>N251B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>AMIL1791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flaming/Brown micropipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-87</td>
<td>Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook</td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models</td>
</tr>
<tr>
<td>Pipette Holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>MP-S15A</td>
<td>Will vary with micromanipulator and pipette O.D.</td>
</tr>
<tr>
<td>Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>5067-1511</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

transcriptome analysis of single cells

كثير من تقنيات تحليل الجينات التعبير تعتمد على المواد المعزولة من السكان غير متجانسة من الخلايا من أنسجة أو خلايا الخليط في الثقافة. 1،2،3 في حالة من الدماغ ، مثل مناطق قرن آمون تحتوي على ترتيبات معقدة لأنواع مختلفة من الخلايا ، ولكل منها ملامح متميزة مرنا. القدرة على حصاد الخلايا واحد يسمح لمزيد من العمق في التحقيق في الخلافات بين الدول وداخلها الجزيئية السكان الخلية. نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة لحصاد الخلايا لمزيد من المعالجة. وتستخدم ماصات غالبا ما تستخدم في عزل الكهربية (باستخدام الطموح) خلية من الاهتمام ودائع مريح هو داخل أنبوب إيبندورف لمزيد من المعالجة مع أي عدد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. يمكن تعديل البروتوكول لدينا محصول من التشعبات من الثقافة الخلية أو الخلايا الفردية حتى من شرائح حادة. نحن أيضا وصف أسلوب التضخيم آرنا كتطبيق في اتجاه مجرى النهر الرئيسي للالعزلة خلية واحدة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب من قبل مختبرنا كبديل لغيرها من تقنيات تحليل الجينات التعبير مثل النسخ والخلف أو في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). 4،5،6،7،8 هذا الأسلوب يوفر لتضخيم خطية من مذيل بعديد الأدينيلات RNA مع بداية femtograms فقط من المواد ونتج عن ذلك مبالغ ميكروغرام من الحمض النووي الريبي العقاقير. المادة تضخيم خطي يقدم تقدير أكثر دقة من التضخيم PCR الأسي من الوفرة النسبية للعناصر transcriptome للخلية معزولة. الإجراء الأساسي يتكون من مجموعتين من التضخيم. لفترة وجيزة ، تأسست فيها بوليميريز RNA T7 موقع مروج [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل في ضعف النصوص التي تم إنشاؤها من مرنا. تتم بعد ذلك بين عشية وضحاها في النسخ المختبر (IVT) التي تفاعل البلمرة T7 RNA تنتج العديد من النصوص العقاقير من [كدنا] مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل. الجولة الثانية تكرر هذه العملية ولكن مع بعض الاختلافات الفنية منذ البداية هي مادة الحمض النووي الريبي العقاقير. ذلك هو المعيار لتكرار الجولة الثانية ، مما أدى في ثلاث جولات من التضخيم. في كثير من الأحيان ، يتم تنفيذ الجولة الثالثة في رد فعل المختبر باستخدام النسخ triphosphates نوكليوزيد biotinylated بحيث يمكن تهجين الحمض النووي الريبي العقاقير المنتجة والكشف على ميكروأري. 7،8

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptome Analysis of Single Cells at JoVE.com

Transcriptome Analysis of Single Cells

نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.

Transcriptome تحليل خلايا مفردة

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

29.5K Views.  University of Pennsylvania. نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.

Video: Transcriptome Analysis of Single Cells

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, formed by ribosomes, mRNAs, several proteins and non-coding RNAs, represent integrated platforms where translational controls take place. However, while the ribosome has been widely studied, the organization of polysomes is still lacking comprehensive understanding. Thus much effort is required in order to elucidate polysome organization and any novel mechanism of translational control that may be embedded. Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that allows the acquisition of 3D images at nanoscale resolution. Compared to electron microscopy (EM) techniques, one of the main advantages of AFM is that it can acquire thousands of images both in air and in solution, enabling the sample to be maintained under near physiological conditions without any need for staining and fixing procedures. Here, a detailed protocol for the accurate purification of polysomes from mouse brain and their deposition on mica substrates is described. This protocol enables polysome imaging in air and liquid with AFM and their reconstruction as three-dimensional objects. Complementary to cryo-electron microscopy (cryo-EM), the proposed method can be conveniently used for systematically analyzing polysomes and studying their organization.

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of the PNS are affected by injury and disease, affecting the nerve function and the capacity for regeneration. Neuronal immune cells are commonly analyzed by immunofluorescence (IF). While IF is essential for determining the location of the immune cells in the nerve, IF is only semi-quantitative and the method is limited to the number of markers that can be analyzed simultaneously and the degree of surface expression. In this study, flow cytometry was used for quantitative analysis of leukocyte infiltration into sciatic nerves or dorsal root ganglions (DRGs) of individual mice. Single cell analysis was performed using DAPI and several proteins were analyzed simultaneously for either surface or intracellular expression. Both sciatic nerves from one mouse that were treated according to this protocol generated &#8805; 30,000 single nucleated events. The proportion of leukocytes in the sciatic nerves, determined by expression of CD45, was approximately 5% of total cell content in the sciatic nerve and approximately 5-10% in the DRG. Although this protocol focuses primarily on the immune cell population within the PNS, the flexibility of flow cytometry to measure a number of markers simultaneously means that the other cells populations present within the nerve, such as Schwann cells, pericytes, fibroblasts, and endothelial cells, can also be analyzed using this method. This method therefore provides a new means for studying systemic effects on the PNS, such as neurotoxicology and genetic models of neuropathy or in chronic diseases, such as diabetes.

Quantitative analysis of cell content within the murine sciatic nerve is difficult due to the scarcity of the tissue. This protocol describes a method for tissue digestion and preparation that provides sufficient cells for flow cytometry analysis of immune cell populations from nerves of individual mice.

تحليل للخلايا المناعية في واحد الوركي الأعصاب والعقدة الظهرية الجذرية من ماوس واحدة باستخدام التدفق الخلوي

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment called the Cajal body. However, sequences that direct snRNA localization into this subnuclear structure have not been known until recently. To determine sequences important for accumulation of snRNAs in Cajal bodies, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs followed by their localization inside cells. First, we prepared snRNA deletion mutants, synthesized DNA templates for in vitro transcription and transcribed snRNAs in the presence of UTP coupled with Alexa488. Labelled snRNAs were mixed with 70 kDa-Dextran conjugated with TRITC, and microinjected to the nucleus or the cytoplasm of human HeLa cells. Cells were incubated for 1 h and fixed and the Cajal body marker coilin was visualized by indirect immunofluorescence, while snRNAs and dextran, which serves as a marker of nuclear or cytoplasmic injection, were observed directly using a fluorescence microscope. This method allows for efficient and rapid testing of how various sequences influence RNA localization inside cells. Here, we show the importance of the Sm-binding sequence for efficient localization of snRNAs into the Cajal body.

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving various cellular compartments. Here, we employed microinjection of fluorescently labelled snRNAs in order to monitor their transport inside the cell.

تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.