هذا العمل كان يدعمها "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" (148808 و 148792)، وأيده سراج الدين القلب ومؤسسة السكتة الدماغية، ومنح الموظفين من مكتب مقاطعة أونتاريو، وآذار/مارس من الدايمات، تيد روجرز مركز بحوث القلب ومونك بيتر مركز القلب. XCC حاصل على "زمالة بانتنغ استوفوا". لوس أنجليس يحمل القلب والسكتة الدماغية/ريتشارد لور منحة جائزة.

بيان الأخلاق: تم استعراض هذا البروتوكول والتي أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" في "الشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وامتثالا "المجلس الكندي للعناية بالحيوان".
1. إعداد المخزن المؤقت
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت لسداسي البروم ثنائي الفينيل (موازنة الملح الحل (حبس هانك)، مصل بقرى الحرارة 2% معطل، ألبومين المصل البقري 0.2%). قم بإضافة 10 مل حرارة إبطال ز 1 من ألبومين المصل البقري إلى 500 مل هبس والمصل البقري. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>إعداد المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إبطال الحرارة 2% مصل بقرى 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا، pH 8.0)). إضافة الحرارة 10 مل إبطال المصل البقري و 1 مل من 0.5 م أدتا إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.</li>
</ol>2-وضع العلامات لتعميم الكريات البيضاء
<ol><li>أسيبتيكالي إعداد الماوس المضادة حقن CD45 مع 1 ميكروغرام من جسم مخفف في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) لوحدة تخزين نهائي حقن 200 ميليلتر/الماوس. تحميل وحدة التخزين في محقن الأنسولين ز 28.5 والابتعاد عن الضوء. ملاحظة: استخدام اثنين من الأجسام المضادة مختلفة تسمى fluorochrome المضادة-CD45 أجل منتثر داخل الأوعية (الملون من خلال الإدارة رابعا) التفريق بين من تلطيخ intracardiac (ملون بعد الهضم؛ راجع الخطوة 4).</li>
	<li>
قبل الحارة الفئران (8-12 أسابيع من العمر) وذلك بتعريض الذيل إلى مصباح أحمر حرارة لمدة 5 دقائق. تنبيه: لا أسخن الحيوان. يبقى المصباح على مسافة آمنة (> 30 سم).<ol>
<li>كبح جماح هذا الحيوان في موقف القصية باستخدام جهاز مناسب. فضح واستقرار الذيل باليد غير المهيمنة بشل حركة قاعدة الذيل مع الفهرس والإصبع الأوسط والمنطقة منتصف القاصي الذيل مع الإبهام والبنصر. تنبيه: لا تنطبق كثيرا قوة في طرف الذيل كما يمكن سحب الجلد. أدخل الإبرة مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه في هذا السياق. تبقى الإبرة موازية لهذا السياق في جميع الأوقات كما أنه من السهل ثقب في الوريد. ملاحظة: قد تحدث الدم إدخال المحاقن وهو علامة على حقنه جيدة. يمكن الانحناء الإبرة بزاوية 90 درجة لتيسير الإدارة رابعا. تأكيد مع مكتب السلامة الخاصة بك كما الإبر الانحناء قد تمثل خطرا.</li>
		<li>ضخ 200 ميليلتر عن طريق الوريد في الوريد الذيل. السائل ينبغي أن تتدفق بسهولة ومؤقتا واضحة في السياق. تنبيه: لا قوة السائل في إذا تم الوفاء بالمقاومة. وهذا دليل على فقدان الإبرة.</li>
		<li>السماح بجسم مضاد لتعميم لمدة 5 دقائق قبل يوثانيزينج إنسانية الماوس.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-قلب عزل والهضم
<ol><li>
Euthanize CO2 باستخدام الماوس أو بواسطة الإجراء القتل الرحيم المقبولة من الناحية الأخرى.
	<ol>
<li>ضع الماوس في الدائرة2 CO CO2 القتل الرحيم، وتعيين معدل التعبئة إلى 20 في المائة حجم الدائرة للدقيقة الواحدة (أي، إذا كانت الدائرة هي 10 لتر، التعبئة في 2 لتر في الدقيقة). تشغيل للماوس 2 دقيقة ومراقبة حتى توقف التنفس.</li>
		<li>إيقاف CO2 واترك الماوس للحد أدنى 1-2 إضافية تضمن توقف التنفس قبل فتح الدائرة وأداء قرصه تو لتأكيد الماوس ميت قبل الشروع في عملية الماوس.</li>
	</ol>
</li>
	<li>رذاذ الماوس مع الإيثانول 70%. رفع الجلد في البطن وتشريح الماوس بالقطع على طول خط الوسط البطني بداية على مستوى الوركين حتى القص. فتح البطن ونقل الكبد لفضح الحجاب الحاجز.</li>
	<li>
قطع الحجاب الحاجز، ثم الأضلاع على جانبي خط الوسط، مع الحرص على تجنب ثقب في الرئتين والقلب.
	<ol>
<li>فضح القلب تقشير مرة أخرى على أضلاعه، ثم قطع الأول تليها الاذينين الأيسر الاذينين الأيمن. تنبيه: كن حذراً عند قطع الاذينين، ضمان وأصيب لا الشرايين أو الأوردة، كهذا يمكن أن يقلل من كفاءة التنظيف الدم الوارد في الأجهزة.</li>
		<li>نتخلل القلب مع 15 – 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة استخدام المحاقن 60 مل مزودة بإبرة ز 21 وبرنامج تلفزيوني الباردة. بلطف فهم قاعدة القلب بالملقط وأدخل الإبرة في البطين الأيسر قرب القمة. كرر الإجراء في البطين الأيمن. النتائج حقن مناسبة في الأبيض الرئتين والكبد شاحبة. ملاحظة: ينبغي إجراء نضح خلال 5 دقائق بعد القتل الرحيم تفاديا تخثر الدم، التي يمكن أن تلوث أجهزة الاهتمام بتعميم خلايا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
اضغط قاعدة القلب بالملقط ولطف سحب القلب، ثم فصل القلب بقطع الشرايين الرئوية الرئيسية والاوردة والشريان الاورطي وكيس التامور.
	<ol>
<li>تنظيف القلب بعقد القلب بين الإبهام والأصابع الفهرس بلطف بمنشفة ورقية نظيفة خالية من الوبر وسحب قبالة الاذينين وبقايا الشرايين الرئيسية وعروق وأي ملوثات أخرى مع الملقط. ملاحظة: تأكد من إزالة بأكملها الاذينين ولا أنسجة أخرى، مثل الرئة أو الأوعية الدموية، وموجودة كهذه الأنسجة الخاصة بهم الخلايا المناعية المقيم. الرئة خاصة يبلغ عدد سكانها كبير خلايا المناعية التي يمكن أن تخفي السكان أصغر من تلك التي تدخل عضلة القلب.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مكان القلب في طبق بلاستيك 5 سم مع 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
	<ol>
<li>تخطر على قلب استخدام مقص تشريح منحنية حتى هناك لا أجزاء مرئية ولها وجود اتساق سلس. ملاحظة: محاولة لإبقاء القلب في منطقة وارد في الطبق أثناء تقطيع للتقليل من فقدان الأنسجة.</li>
		<li>نقل الأنسجة ثيتريتوراتيدهيرت باستخدام الملقط منحنى في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع النسر المتوسط تعديل (دميم في 800 ميليلتر الباردة دولبيكو).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إضافة 450 U/mL أوفكولاجيناسي الأول، 60 يو/مليلتر من البروتين السكري المثبط نوع أنا-S و 60 يو/مليلتر من الدناز-الأول لكل عينة.
	<ol>
<li>احتضان عينات في 37 درجة مئوية في شاكر هزاز 50 لفة في الدقيقة لمدة 45 – 60 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
بعد الهضم، بإيجاز دوامة عينات (20 ق) ثم ضع فورا على الجليد الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية.
	<ol>
<li>استخدام بيبيتور 1 مل، "الماصة؛" عينات صعودا ونزولاً حتى عينات الأنسجة تكون متجانسة ولا تسد نصيحة ماصة. ملاحظة: تحديد عدد محدد من المرات "الماصة؛" قد يزيد من إمكانية تكرار نتائج. إذا لم يتم هضمها القلوب على الوجه الأمثل، قد يعرقل قطعة من عضلة القلب الماصة. بلطف طحن نصيحة ماصة ضد أنبوب ميكروسينتريفوجي سيساعد على تجانسه قطعة أكبر من الأنسجة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
قبل الرطب 40 ميكرومتر خلية مصفاة توضع في أنبوب 50 مل مخروطية مع 1 مل من البرد سداسي البروم ثنائي الفينيل.
	<ol>
<li>إضافة نموذج المتجانس للتصفية وتغسل من خلال بصب 12 – 14 مل الباردة سداسي البروم ثنائي الفينيل ببطء.</li>
		<li>نقل العينات التي تمت تصفيتها إلى أنبوب مخروطي توسم 15 مل والحفاظ على 4 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.
	<ol>
<li>خلايا الدم الحمراء بإضافة 1 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت لكل عينة. ريسوسبيند عينات من فورتيكسينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.</li>
		<li>وبمجرد الانتهاء من تفسخ، إضافة 5 – 8 مل من متوازن الملح الحل (حبس البرد هانك) لوقف انحلال الدم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الطرد المركزي عينات في غفور 400 x 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.</li>
	<li>أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي توسم 1.5 مل. ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ليصل إلى 2 حاء مع العينات المخزنة في 4 درجات مئوية.</li>
</ol>4-التدفق الخلوي تلطيخ والتحليل
<ol><li>
عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
	<ol>
<li>للحد من جسم غير محدد ملزم، تضعف من 1: 100 المضادة-CD16/CD32 و "مانع الوحيدات" (01:20) (انظر الجدول للمواد) في حساب 50 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.</li>
		<li>إعداد حصر تمييع (1: 250 لكل جسم) جسم 50 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة. ملاحظة: يمكن تضمين صبغة بقاء في جسم كوكتيل بغية استبعاد الخلايا الميتة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون الاستبعاد صغيرة الحجم بتحليل تدفق المستخدمة (الشكل 1ج ود).</li>
		<li>دون الغسيل، إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي الأجسام المضادة لكل عينة وخلط.</li>
		<li>احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 600 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة لغسل والطرد المركزي عينات من 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>نضح قبالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية. الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية في الظلام. ملاحظة: تتطلب بعض الأصباغ البقاء، مثل DAPI، تلطيخ داخل 10 دقيقة قبل تشغيل التدفق الخلوي.</li>
	<li>تحليل من خلال التدفق الخلوي (انظر الأرقام 1 و 2) ضمن ح 3 المقبل. إذا كان وقت أطول التثبيت المطلوبة وقصيرة الأجل باستخدام بارافورمالدهيد تركيز منخفض (0.5 – 1% في برنامج تلفزيوني) يوصي بالحفاظ على تلطيخ. ملاحظة: من المستحسن جداً لتصفية عينات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل بدء التدفق الخلوي التحليل منعا لعرقلة فلويديكس سيتوميتير تدفق.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

التهاب عضلة القلب، أو التهاب العضلة القلبية، ميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية أكثر. بيد أن عضلة القلب لا يخلو من مكوناته المناعية في الحالات غير المرضية. أثناء حالة ثابتة، العديد من الخلايا المناعية الموجودة في عضلة القلب ولعب أدوار أساسية لصون وحماية. لم يكن وصف هؤلاء السكان متنوعة من ...

أشكال مختلفة من احتشاء عضلة القلب من الإجهاد أو الإصابة، بما في ذلك الدماغية (ضخه الاسكيمية أو احتشاء عضلة القلب) وغير الدماغية (ارتفاع ضغط الدم أو التهاب العضلة القلبية)، تشجيع تعيين الخلايا الملتهبة مع الترميمي والحماية، لكن أيضا الخصائص المسببة للأمراض. أقرب 1891، رومبيرغ أول وصف وجود تتسرب الخلوية في عضلة القلب للمرضى المصابين ب التيفوس والحمى القرمزية1. بيد أن الدراسة التفصيلية للخلايا المناعية القلب يتطلب تطوير تقنيات أكثر تطورا إيمونوفينوتيبينج. نتيجة لذلك، إلا في الآونة الأخيرة قد بدأنا على فهم أن عدد سكان متنوعة من الخلايا المناعية مع أدوار الصيانة الضرورية أثناء حالة ثابتة يتواجد داخل عضلة القلب.
وقد علم الأنسجة، ولا يزال، الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوصيف الخلايا المناعية القلب أثناء التهاب. ومع ذلك، حين علم الأنسجة يمثل أداة قيمة لتشخيص، استخدامه في دراسة الخلايا المناعية القلب قد القيود الهامة. تمثل نسبة ضئيلة جداً من مجموع الخلايا الخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب وهي أكثر أو أقل موزعة في مساحة كبيرة نسبيا. وبالمثل، تظهر عدة أشكال من التهاب القلب، مثل فيروسي التهاب العضلة القلبية، أنماط التنسيق من التهاب. وهذا يعني أن التحليل الدقيق للنظام المناعي للقلب غالباً ما تتطلب درجة أعلى من أخذ عينات نسيجية، زيادة التكلفة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك، يوفر علم الأنسجة كمية محدودة جداً من المعلومات يمكن استخدامها في تحديد الخلية (مثل عدد المعلمات). مع عدد متزايد من أي وقت مضى من مجموعات فرعية الخلية التي تتطلب استخدام عدة علامات التعبير (بما في ذلك علامات السطحية أو عوامل النسخ أو جزيئات يفرزها)، التدفق الخلوي أثبتت أنها أقوى أداة إيمونوفينوتيبينج، سبب منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية.
باستخدام تقنيات إيمونوفينوتيبينج يتوقف عن كثب على تطوير كفاءة الهضم البروتوكولات التي تسمح بتحليل خلايا مفردة لإعداد كبيرة من الخلايا. وضع بروتوكولات شاملة لاستخراج خلية فتح نافذة جديدة من الفرص في دراسة علم المناعة القلب. من خلال المزيج من الهضم، والتدفق الخلوي وترانسكريبتوميكس، كان السكان الرئيسية في الضامة، والخلايا الجذعية الذين يقيمون في القلب تتسم2،3. السكان الأكثر وفرة من الخلايا المناعية القلب أثناء حالة ثابتة هي CD64+ميرتك+ الضامة، التي يمكن تقسيمها استناداً إلى التعبير عنها من CCR2 أو CD11c2. CCR2+ الضامة تنبع من هيماتوبويسيس نخاع العظام الكبار، بينما الأغلبية من CCR2 الضامة– ، التي يمكن أن تعبر عن مستويات عالية أو منخفضة من MHC-ثانيا، هم أساسا من أصل قبل الولادة. الضامة المهام الرئيسية مثل إصلاح4 وإزالة الحطام5 أثناء الإصابة أو دعم الربط الكهربائي6 في حالة مستقرة. خلال أشكال مختلفة من التهاب يحدث تدفقا هاما من Ly6Cمرحبا MHC-ثانيالو CD64int وحيدات، التي تفرق في وقت لاحق في Ly6Cمرحبا CCR2+ الضامة2،7 . عدد سكانها الخلايا المقيمين في عضلة القلب الأشخاص الأصحاء أصغر بكثير، ولكن المهم، يتكون من الخلايا الجذعية8،9. واتسمت مؤخرا المجموعات الرئيسية اثنين من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية القلب (المؤلفان): cDC1 (CD103+ وحدات تحكم المجال Dc) و cDC2 (CD11b+ وحدات تحكم المجال Dc). وحدات تحكم المجال Dc تلعب أدواراً هامة في الدفاع ضد العدوى8 ولكن يمكن أيضا أن تعزز المتمتعة بالحكم الذاتي-الإصابة أثناء التهاب، لا سيما أثناء احتشاء عضلة القلب9.
وهنا يصف لنا طريقة بسيطة لعزل الخلايا المناعية القلب قابلة للاستمرار من الماوس عضلة القلب. الأسلوب يجمع بين الهضم الأنزيمي والميكانيكية مع خلية-مصفاة ترشيح بغية الحصول على تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها، أو كذلك تنقيته، التدفق الخلوي الفرز أو تخصيب حبة المغناطيسية. تتطلب قياسات دقيقة لخلايا عضلة القلب اكسترافاسكولار القلب نضح من أجل إزالة الملوثات المحتملة من مجرى الدم ميكروفاسكولاتوري القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم خطوة اختيارية لوسم منتثر داخل الأوعية للخلايا المناعية التي يمكن استخدامها لزيادة التفرقة بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية، على أساس بروتوكول et al. البندقية10. وأخيراً، نقدم تحليل تدفق أساسية الخلوي لتحديد الفئات السكانية الفرعية بلعم ومركز السيطرة على الأمراض الرئيسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

جهاز المناعة عنصر أساسي لصحة القلب. عضلة القلب موطن لعدد سكان الأغنياء من مجموعات فرعية مختلفة من الخلية المناعية مع التقسيم الوظيفي أثناء حالة ثابتة وأشكال مختلفة من التهاب السواء. حتى وقت قريب، دراسة الخلايا المناعية في القلب المطلوب استخدام الفحص المجهري أو تحديد بروتوكولات المتقدمة سوء الهضم، التي قدمت ما يكفي حساسية أثناء التهاب حاد ولكن لم يتمكنوا من ثقة الصغيرة – لكن الرئيسية – السكان الخلايا أثناء حالة ثابتة. هنا، نحن نناقش أسلوب بسيط الجمع الانزيمية (كولاجيناز والبروتين السكري المثبط الدناز) والهضم الميكانيكي من قلوب مورين يسبقه الإدارة داخل الأوعية المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة التفريق بين الصغيرة ولكن لا مفر منه خلية داخل الأوعية الملوثات. ينشئ هذا الأسلوب تعليق خلايا قابلة للحياة المعزولة التي يمكن تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد الهوية، فينوتيبينج والقياس الكمي، أو تنقية كذلك مع الأسفار تنشيط الخلية فرز أو فصل حبة المغناطيسي النسخي دراسات التحليل أو في المختبر . وندرج مثال لتحليل تدفق خطوة بخطوة سيتوميتريك التفريق بين مفتاح بلعم والسكان الخلايا الجذعية للقلب. لتجربة حجم متوسط (10 قلوب) يتطلب انتهاء الإجراء ح 2 – 3.

حتى الآن، لا توجد طريقة جيدة قد صمم لعزل الخلايا المناعية من مكونات القلب خلية أخرى، مثل كارديوميوسيتيس. ومن ثم يتطلب تحليلاً لتعليق خلية مفردة القلب بالتدفق الخلوي النابضة مسبقاً مع CD45 تحديد السكان الخلايا المناعية، وتليها خلية مفردة، وصغر حجم الاستبعاد النابضة (<strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Views.  University Health Network (UHN). ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.

Video: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

مقدمة لالدبابير الطفيلية من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; والاستجابة المناعية Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...