Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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この作品は、カナダの協会の健康調査 (148808 148792) によって支えられた、SE に支えられ心臓・卒中財団、オンタリオ地方事務所、10 セントの行進財団、テッド ・ ロジャース センターの心研究 Peter Munk 人材賞」を受賞心臓センター。XCC 機構バンティング交わりを保持します。ラは、心臓と脳卒中/リチャード ・ Lewar 就労賞を保持します。

倫理ステートメント: このプロトコルがレビューおよび大学健康ネットワーク (トロント、カナダ) で動物ケア委員会によって承認された動物のケアに関するカナダの理事会に準拠して。
1. バッファー準備
<ol><li>HBB バッファー (ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS)、2% の熱不活化ウシ血清、0.2% ウシ血清アルブミン) を準備します。10 mL の熱不活ウシ血清と HBSS の 500 mL にウシ血清アルブミン 1 g を追加します。フィルターは 0.2 μ m のフィルターを通して消毒し、4 ° C で保存</li>
	<li>FACS バッファーを準備 (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、2% の熱不活化牛血清、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、pH 8.0) 1 mM)。10 mL の熱不活ウシ血清と 500 mL の PBS に 0.5 M の EDTA の 1 mL を追加します。フィルターは 0.2 μ m のフィルターを通して消毒し、4 ° C で保存 注: ソリューションは 4 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
</ol>2. 白血球の循環のラベリング
<ol><li>無菌 1 μ g 滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 200 μ L/マウスの最終的な注入量で希釈した抗体の抗マウス CD45 注入を準備します。28.5 G インスリン注射器にボリュームをロードし、光から離れた保ちます。 注: は、(消化後染色; ステップ 4 を参照してください)、心内染色から血管 (静脈投与による染色) を区別するために 2 つの異なる蛍光標識抗 CD45 抗体を使用します。</li>
	<li>
あらかじめ 5 分赤熱ランプに尻尾を公開することによってマウス (8-12 週齢) を温めます。 注意: は、動物を過熱しません。ランプを安全な距離を保つ (> 30 cm)。<ol>
<li>適切なデバイスを使用して胸骨の位置で動物を抑制します。公開し、人差し指と中指で尾の根元、親指と薬指で尾の半ば遠位領域を固定化した非支配的な手と尻尾を安定させます。 注意: は、皮膚引っ張ることができると尾の先端であまりにも多くの力を適用されません。ベベルの静脈に上向きの針を挿入します。静脈を穿刺しやすいように針を常時静脈と平行にしてください。 注記: 注射器に流れ込む血液が発生し、良い注入の印であります。針を 90 ° の角度に曲げ投与を容易にすることができます。曲げ針が危険を表すことができるよう、安全管理室に確認します。</li>
		<li>200 μ L を尾静脈静脈内注入します。流体は、容易に流れるし、静脈を一時的に解除ください。 注意: 抵抗を感じる場合は、液を押し込まないでください。これは、針の紛失のサインです。</li>
		<li>マウスを人道的に安楽死させる前に 5 分間循環する抗体を許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 心を分離して消化
<ol><li>
CO2を用いたマウスを安楽死させる、または他の安楽死制度受け入れられたプロシージャ。
	<ol>
<li>CO2安楽死、CO2チャンバーにマウスを置き、毎分 (すなわち、商工会議所は 10 L、2 L/分で埋める場合) 室容積の 20% にフィル レートを設定します。呼吸が停止しているまで 2 分とモニター マウスを実行します。</li>
		<li>CO2オフにシャット ダウンし、追加の 1-2 分商工会議所を開く前に呼吸が停止していることを確認マウスを残してつま先ピンチ マウスがマウスの処理に進む前に死んだことを確認するを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>70% のエタノールとマウスをスプレーします。腹部の皮膚を持ち上げて、胸骨まで腰のレベルで腹側正中初めに沿って切断することによってマウスを解剖します。腹部を開き横隔膜を公開する肝臓を移動します。</li>
	<li>
肺と心臓を刺さないように注意しながら、正中線の両側に、横隔膜、肋骨をカットします。
	<ol>
<li>剥離による心臓当時は肋骨、左心房、右心房続いてカット最初を公開します。 注意: は、この臓器に含まれている血液のフラッシュの効率が低下することができます、動脈や静脈、負傷者なしを確保、心房をカットするときに注意を使用します。</li>
		<li>15-20 ml 21 G 針装備 60 mL の注射器を使用して冷たい PBS と冷 PBS の心臓を灌流します。優しく鉗子で心の底をつかみ、左の心室の頂点近くに針を挿入します。右心室の手順を繰り返します。適切な注入は、白い肺と淡い肝臓の結果します。 注: 灌流は、血液凝固は、細胞を循環と利子の器官を汚染することができますを避けるために安楽死した後 5 分以内で実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
鉗子で心のベースを保持し、優しく心を引き上げて、主要な肺動脈と静脈、大動脈、心膜の袋を切断することによって心をデタッチします。
	<ol>
<li>きれいな糸くずペーパー タオルで優しく親指と人差し指の間心を保持することによって、心をきれいにし鉗子と心房と主要な動脈と静脈および他の汚染物質の残党をやってのけます。 注: は、心房全体が削除され、肺や血管などの他の組織が存在しないこれらの組織が自分の居住者の免疫細胞を持っているを確認します。肺特に心筋内のそれらのより小さい人口をマスクすることができます大規模な免疫細胞の人口があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
冷 PBS の 50 μ L で 5 cm のプラスチックの皿の中心を配置します。
	<ol>
<li>表示部分がない、滑らかな整合性まで湾曲した解剖はさみを使用して心臓をミンチします。 注: は、組織の損失を最小化するまな板中皿の含まれる領域で心を維持してください。</li>
		<li>2 mL 遠心チューブ 800 μ L 冷たいダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) とにカーブタイプ鉗子を用いた thetrituratedheart 組織に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
私、ヒアルロニダーゼ型私 - s、60 U/mL と DNase の 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase を追加-各サンプルに。
	<ol>
<li>45-60 分間で 50 rpm ロッキング シェーカーで 37 ° C でサンプルをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
消化力の渦のサンプルに簡潔に後 (20 s)、すぐに 4 ° C でサンプルを保つために氷の上
	<ol>
<li>組織サンプルが均一、ピペット チップを詰まらせるれませんまで上下サンプルのピペット 1 mL pipettor を使用します。 注: は、再現性を高める可能性がありますピペットに特定回数を定義します。心は最適な消化されない場合心筋の部分ピペットを妨害する可能性があります。遠心チューブに対してピペット先端を軽く研削と、組織の大きな部分を均質化に役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
あらかじめ冷たい HBB の 1 mL を 50 mL の円錐管に 40 μ m セル ストレーナーを濡れています。
	<ol>
<li>フィルターに均質化サンプルを追加し、ゆっくり冷たい HBB の 12-14 mL を注いでを介して洗浄します。</li>
		<li>4 ° C でラベルの 15 mL の円錐管にフィルターが適用されたサンプルを転送し、</li>
	</ol>
</li>
	<li>
4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離機サンプル上清を離れて吸い出しなさい。
	<ol>
<li>各サンプルに 1 mL のアンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーを追加することで赤血球を溶解させます。ボルテックスによってサンプルを再懸濁します、5 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>溶解が完了すると、5-8 mL の冷たいハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 溶血を停止するを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機の 400 x「アウトドア 4 ° c で 5 分間のサンプル上清を離れて吸い出しなさい。</li>
	<li>各サンプルとラベル付き 1.5 mL 遠心チューブへの転送に 1 mL の FACS バッファーを追加します。 注: プロトコルを一時停止できるここで 2 h までの 4 ° C で保存のサンプル</li>
</ol>4 流れの Cytometry の染色と分析
<ol><li>
4 ° C で 5 分間 400 × gで遠心分離機サンプル
	<ol>
<li>非特異抗体の結合を減らすためには、1: 100 抗 CD16/CD32 および単球ブロック (1:20) を希釈サンプルあたり 50 μ L FACS 会計 (材料の表を参照)。15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>50 μ L のサンプル/FACS のため抗体希釈 (各抗体 1: 250) 会計を準備します。 注: 生存率色素抗体カクテルで死んだ細胞を除外するために含めることができます。また、使用される (図 1CとD)、流れ解析による小型除外もあります。</li>
		<li>洗浄せず抗体各サンプルし、ミックス マスター ミックスの 50 μ L を追加します。</li>
		<li>暗闇の中で 30 分間、4 ° C でサンプルをインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗浄し、遠心分離機の 4 ° C で 5 分間 400 x gでサンプルごとのサンプルを 600 μ L FACS を追加します。</li>
	<li>上清を吸引し、300 μ L FACS でペレットを再懸濁します。暗闇の中で 4 ° c のサンプルを保ちます。 注: フローサイトメトリーを実行する前に 10 分以内で染色 DAPI など、いくつかの生存の染料が必要です。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる分析 (図 1 および図 2を参照) 次の 3 時間以内。長い時間が必要な短期的固定低濃度パラホルムアルデヒドを使用して場合 (0.5-1 %pbs) 染色を維持するためにお勧めします。 注: 開始フロー フローサイトメトリー分析の前に 40 μ m セル ストレーナー流れの cytometer の流体工学の妨害を防ぐためにサンプルのフィルターを適用することを勧めします。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

心筋の炎症や心筋炎、最も心血管疾患の機能であります。ただし、心筋はありません非病気の状態で、独自の免疫のコンポーネントを欠いています。定常状態の時に多くの免疫細胞は、心筋に存在し、保守と保護の不可欠な役割を果たします。細胞のこれらの多様な人口の特性はこのプロトコルで発表したものなどの方法なしで可能をでしょう。
心筋の機械的および酵?...

心筋応力または損傷、虚血を含む (虚血再灌流や心筋梗塞) の異なった形態と非虚血性 (高血圧や心筋炎) も修復と保護、炎症細胞の募集を促進します。病原性のプロパティ。1891 年には早くもラコストは最初に発疹チフス、猩紅熱の1に感染した患者の心筋細胞の浸潤の存在を説明しました。ただし、心筋免疫細胞の詳細な研究に必要なより高度な診療技術の開発。その結果、ごく最近我々 は定常状態の間に本質的なメンテナンスの役割を持つ免疫細胞の多様な人口が心筋内に存在することを理解し始めています。
組織されているとまだ、炎症における免疫細胞を特徴付ける最も一般的な方法です。しかし、組織は、貴重な診断ツール、心の免疫細胞の研究での使用で重要な制限があります。心筋に存在する免疫細胞は総細胞の非常に小さい割合を表すし、比例して巨大空間でもっとまたはより少なく均等に分散します。同様に、ウイルス性心筋炎など、心筋の炎症のいくつかのフォームは、炎症の焦点のパターンを示します。つまりは心の免疫システムの正確な分析がしばしば組織学的サンプリング、バイアスを減らすためのコストの増加の高い学位を必要とします。また、組織は、細胞の識別 (例えばパラメーターの数) で使用可能な情報の非常に限られた量を提供します。細胞サブセット (表面マーカー、転写因子分泌分子など) 複数の式マーカーの使用を必要とする数が増え、フローサイトメトリーは、診療の最も強力なツールとして地位を確立して低コスト、高スループット。
診療技術の使用は多数細胞の単一細胞分析のできる効率的な消化力のプロトコルの開発に密接に依存します。細胞抽出の徹底的なプロトコルの開発は、心臓の免疫学の研究で機会の新しいウィンドウを開きます。消化、フローサイトメトリー、トランスクリプトームの組み合わせを介してマクロファージと樹状細胞の中心部に存在する主要な人口は特徴付けられる2,3をされています。安定状態で心臓の免疫細胞の最も豊富な人口が CD64+MerTK+ CCR2 または CD11c2の表現に基づいてさらに分けることができますマクロファージ。CCR2+に対し、マクロファージが成人の骨髄造血に属します大半 CCR2 の MHC-II の高または低のレベルを表現できる、-マクロファージが出生前の起源の主に。マクロファージは、修理4傷害または定常状態における電気的接続6のサポート中に破片5の除去など主要な機能を実行します。異なるフォームの炎症の時に Ly6CこんにちはMHC-IIlo CD64int単球の重要な流入発生、これは後に Ly6CこんにちはCCR2 分化+マクロファージ2,7.健常者の心筋に存在する細胞のかなり小さいが重要な人口樹状細胞8,9で構成されます。心臓従来 Dc (cDCs) の 2 つの主要なサブセットが最近特徴付けられる: cDC1 (CD103+ Dc)、cDC2 (CD11b+ Dc)。Dc は感染8に対して防衛で重要な役割を果たすが、促進炎症、心筋梗塞9特に中に自傷をすることも。
ここでは、単純なマウス心筋から心臓免疫細胞の分離法について述べる.メソッドは、分析、または流れの cytometry の並べ替えまたは磁気ビーズ濃縮により更に精製できる単一細胞懸濁液を得るためにセル ストレーナー濾過と酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。管外の心筋細胞の正確な測定は、心臓の血管の血流からの可能な汚染物を除去するために心筋灌流を必要があります。さらに、さらに撮影らプロトコル10に基づく血管内の汚染物質から心筋細胞を区別する使用ことができます免疫細胞の血管内ラベリングのオプションの手順を提案する.最後に、主要なマクロファージと cDC のサブポピュレーションを識別するために基本的な流れフローサイトメトリー解析を提案します。

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Wisent</td><td>311-511-CL</td><td>1x HBSS</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>BioShop</td><td>EDT111</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum filter , 0.2 &amp;micro;m Filtropur V50</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.001</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1/2 1 cc insulin syringe</td><td>BD</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>60 mL syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>from Clostridium histolyticum</td></tr><tr><td>Hyaluronidase type I-S</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma</td><td>D4513</td><td>from bovine pancreas</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td><td>Lonza</td><td>10-546E</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td><td>Biolegend</td><td>128025</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD103</td><td>Biolegend</td><td>121414</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6G</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td><td>Biolegend</td><td>116422</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td><td>Biolegend</td><td>139315</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103113</td><td>1:250 dilution</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>1:40 dilution</td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>True-Stain Monocyte Blocker</td><td>Biolegend</td><td>426101</td><td>1:20 dilution</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar Inc</td><td></td><td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td></tr><tr><td>Mouse: Batf3-/-</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX: 013755</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

免疫システムは、健康な心臓の重要なコンポーネントです。心筋は、定常時および炎症の異なった形態の間に機能区分と異なる免疫細胞サブセットの豊富な人口に家。最近まで、心で免疫細胞の研究に必要な顕微鏡を使用または小さな未発達の消化力のプロトコル、重度の炎症の中に十分な感度を提供が、自信を持ってすることができませんでしたを識別する-キーですが-の人口安定状態でセルです。ここでは、簡便な合成酵素 (コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼや DNAse) と前に小を区別する蛍光標識抗体の血管内投与マウスの心の機械的消化について述べるが、やむを得ない血管内細胞の汚染物質。このメソッドは、識別、表現型解析と定量化、フローサイトメトリーで分析したまたは蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気ビードの分離のために更に精製できる分離の実行可能な細胞の懸濁液を生成します転写の解析または生体外で研究。キーのマクロファージと樹状細胞集団の中心部を区別するためにステップバイ ステップ フローサイトの例が含まれています。中規模実験 (10 心) プロシージャの完了には 2-3 h が必要です。

日には、よい方法設計されていますない心筋細胞など、他のコンポーネントの心筋細胞から免疫細胞を分離します。したがって、CD45 続く単一セルおよび小型除外ゲート (図 1A) 免疫細胞群を識別するために、あらかじめゲーティング フローサイトメトリーによる心筋単一細胞懸濁液の分析が必要です。また、死んだ細胞を除外する?...

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

心の血管外免疫細胞の分離と同定

このプロトコルを分離、識別し、定常状態や炎症の間にマウスの心筋に存在する免疫細胞を定量化するシンプルかつ効率的な手法を提案します。プロトコルは、フローサイトメトリーによるさらに分析することができます単一細胞懸濁液の生成のための酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.6K ビュー.  University Health Network (UHN). このプロトコルを分離、識別し、定常状態や炎症の間にマウスの心筋に存在する免疫細胞を定量化するシンプルかつ効率的な手法を提案します。プロトコルは、フローサイトメトリーによるさらに分析することができます単一細胞懸濁液の生成のための酵素的及び機械的消化を組み合わせたものです。

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

免疫・感染学

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

発生生物学

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. However, the literature reports contrasting data on the prevalence of myocardial B-cells. B-cells have been reported to be both among the most prevalent immune cells in the rodent heart or to be present, but at a markedly lower prevalence than myeloid cells, or to be quite rare. Similarly, several groups have described that the number of myocardial B-cells increases after acute ischemic myocardial injury, but one group reported no changes in the number of B-cells of the injured myocardium. Implementation of a shared, reproducible method to assess the prevalence of myocardial B-cells is critical to harmonize observations from different research groups and thus promote the advancement of the study of B-cell myocardial interactions. Based on our experience, the seemingly contrasting observations reported in the literature likely stem from the fact that murine myocardial B-cells are mostly intravascular and connected to the microvascular endothelium. Therefore, the number of B-cells recovered from a murine heart is exquisitely sensitive to the perfusion conditions used to clean the organ and to the method of digestion used. Here we report an optimized protocol that accounts for these two critical variables in a specific way. This protocol empowers reproducible, flow cytometry-based analysis of the number of murine myocardial B-cells and allows researchers to distinguish extravascular vs. intravascular myocardial B-cells.

Here we report a protocol for the quantification and differentiation of myocardial B-lymphocytes based on their location in the intravascular or endothelial space using flow cytometry.

フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

医学

マウスの肺静脈の心筋構造の解明

Microdissection and Immunofluorescence Staining of Myocardial Sleeves in Murine Pulmonary Veins

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial fibrillation (AF). PVs contain myocardial sleeves (MS) composed of cardiomyocytes. MS are implicated in the initiation and maintenance of AF, as they preserve similarities to the cardiac working myocardium, including the ability to generate ectopic electrical impulses. Rodents are widely used and may represent excellent animal models to study the pulmonary vein myocardium since cardiomyocytes are widely present all over the vessel wall. However, precise microdissection and preparation of murine PVs is challenging due to the small organ size and intricate anatomy.
We demonstrate a microscopy-guided microdissection protocol for isolating the murine left atrium (LA) together with the PVs. Immunofluorescence staining using cardiac Troponin-T (cTNT) and connexin 43 (Cx43) antibodies is performed to visualize the LA and PVs in full length. Imaging at 10x and 40x magnification provides a comprehensive view of the PV structure as well as detailed insights into the myocardial architecture, particularly highlighting the presence of connexin 43 within the MS.

著者スポットライト:種を超えた心房細動研究のためのトランスレーショナルモデルの開発 

This protocol demonstrates microscopy-guided isolation and immunofluorescence staining of murine pulmonary veins. We prepare tissue samples containing the left atrium, pulmonary veins, and the corresponding lungs and stain them for cardiac Troponin T and Connexin 43.

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

Pulmonary veins (PVs) are the major source of ectopic beats in atrial arrhythmias and play a crucial role in the development and progression of atrial ...

心の血管外免疫細胞の分離と同定

要約

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機能心臓の免疫細胞の単離

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

催不整脈性心筋症患者の心内膜心筋生検サンプルから心臓の間葉系間質細胞の分離と性状

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

ヒトおよびマウスの心筋標本からのマクロファージサブセットおよび間質細胞の分離

フローサイトメトリーによる心筋B細胞の定量および分析(英語)

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色

マウス肺静脈における心筋スリーブの微小解剖および免疫蛍光染色