وصفنا بروتوكولا للتشريح المجهري والعزل اللاحق للعاثيات الدقيقة المقيمة في القلب عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة على وجه التحديد من الجيوب الأنفية والعقدة الأذينية البطينية في الماوس. من خلال التشريح الدقيق للجيوب الأنفية والعقدة V ، متبوعا بمزيج من فرز الخلايا المغناطيسية والمنشطة بالفلورة ، نحن قادرون على عزل البلاعم المقيمة على وجه التحديد من الجيوب الأنفية والعقدة V بنقاوة عالية. يسمح تحديد وعزل البلاعم القلبية المقيمة من مناطق متميزة في القلب بإجراء مزيد من الدراسة لنمطها الظاهري وتأثيرها الخاص بالمنطقة على الفيزيولوجيا الكهربية للقلب.
بعد عزل القلب ، قم بإجراء عمليات التشريح المجهري في طبق تشريح مع برنامج تلفزيوني بارد لمرة واحدة تحت مجهر تشريح. استخدم المعالم التشريحية القلبية مثل الشريان الأورطي والشريان الرئوي والجيب التاجي والبطين الأيسر أو الأيمن لتحديد اليسار واليمين والأمامي الخلفي للقلب. بعد تحديد الاتجاه ، ضع القلب مع الجبهة في أسفل الطبق لفضح الأوردة الكبيرة الخلفية.
قطع على طول الأخدود بين البطينين والأذينين لإزالة غالبية البطينين. الحفاظ على الجزء الأذيني. ثبت القلب في طبق التشريح عن طريق إدخال دبابيس من خلال الجزء المتبقي من الجدار الخالي من LV و LAA.
اقطع الجدار المتبقي الخالي من المركبات الترفيهية لأعلى من خلال الصمام ثلاثي الشرف والوريد الأجوف العلوي. اقلب RA و RV بعيدا وقم بتثبيت RAA لكشف منطقة تجويف RA والحاجز الأذيني. بالنسبة للتشريح المجهري ل SAN ، قم بقطع القلب على طول الحاجز بين الأذينين الموازي لمحطة crista لفصل المنطقة البينية للحصول على عينة SAN.
ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق فارغ سعة 1.5 ملليلتر على الثلج. للتشريح المجهري للانسدادي اللاوعائي، قم بتثبيت الأجزاء المتبقية من القلب من خلال الأنسجة المجاورة للحاجز بين الأذينين والحاجز بين البطينين لمواجهة الجانب الأذيني الأيمن من الحاجز بين الأذينين. انظر إلى الأذين الأيمن على سطح الشغاف لمثلث كوخ الذي سيحده من الأمام خط مفصلي نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف وخلفيا وتر تودارو.
لوحظ فتحة الجيب التاجي في القاعدة. فرم أنسجة SAN و AVN باستخدام المشارط. ثم أضف 500 ميكرولتر من مخزن الهضم الطازج إلى كل عينة واغسل جميع الأنسجة المفرومة من جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ماصة بلطف للمساعدة في هضم العينة وتجانس الأنسجة على آلة دوامة. بعد الهضم ، انقل تعليق الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 ملليلتر عن طريق تمريره عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر. شطف مصفاة الخلية مع خمسة ملليلتر إضافية من عازلة فرز الخلايا لوقف عملية الهضم.
إزالة طاف . بعد إعادة تعليق حبيبات الخلية ب 90 ميكرولترا من المخزن المؤقت لفرز الخلايا ، أضف 10 ميكرولتر من ميكروبيدات CD45 لكل 10 ملايين خلية إجمالية إلى معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر. خلط العينات جيدا.
خلال وقت احتضان تعليق الخلية بالميكروبيدات وخليط الأجسام المضادة ، قم بإعداد مجموعة الفصل المغناطيسي عن طريق ربط العمود المغناطيسي بفاصل مغناطيسي مناسب ثم وضع أنبوب تجميع تحت العمود المغناطيسي. قم بإعداد الأعمدة المغناطيسية عن طريق الشطف باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المضافة في الجزء العلوي من العمود والسماح للمخزن المؤقت بالمرور. ضع تعليق الخلية على الفور على العمود ، وتجنب فقاعات الهواء ، أثناء مرور المخزن المؤقت لفرز الخلايا.
اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لفرز الخلايا على العمود. قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وضعه على أنبوب تجميع جديد.
اغسل العمود على الفور عن طريق تطبيق المكبس المزود بالعمود بإحكام للحصول على التدفق الذي يحتوي على الخلايا المسماة مغناطيسيا. بعد تطبيق العينة غير الملوثة وأنابيب التعويض ، اضبط الفولتية لكل قناة لمحاذاة كل من القمم الموجبة والسالبة إلى الموضع المناسب للمحور. قم بتعيين استراتيجية البوابة كما هو موضح في مخطوطة النص باستخدام DAPI كعلامة جدوى.
تحقق من مخططات قياس التدفق الخلوي للتأكد من أن عدد الخلايا محل الاهتمام يظهر بشكل صحيح على الرسوم البيانية. اجمع الخلايا المصنفة إلى وسط أو مخزن مؤقت بناء على الحاجة إلى التجارب اللاحقة. لتأكيد التشريح الصحيح ، تم تحديد SAN و AVN باستخدام تلطيخ الفلورسنت المناعي وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان.
يظهر هنا تلطيخ مناعي لخلايا نظام التوصيل الإيجابي HCN4 في SAN و AVN ، بالإضافة إلى تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان ل SAN و AVN. ساعدت استراتيجية البوابة لفرز الخلايا من الضامة القلبية المقيمة على تحديد الخلايا أحادية النواة عن طريق استبعاد الثنائيات في منطقة التشتت الأمامية للمحور ص مقابل المحور السيني. تم استبعاد الخلايا الميتة بواسطة DAPI.
تم بوابات الخلايا الحية للكريات البيض الإيجابية CD45 ، ثم للخلايا النخاعية الإيجابية CD11b. تم تحديد البلاعم القلبية من خلال التعبير عن كل من F4 / 80 و CD64 ، ثم تم تقسيمها إلى طبقات بواسطة تعبير مستضد الخلايا الليمفاوية السادس. لوحظت خلايا تم فرزها حديثا تحت المجهر برايتفيلد.
كانت الخلايا إيجابية ل CD45 عند ملاحظتها تحت قناة PE الفلورية. عند ملاحظتها تحت قناة فلوروفور APC بحجم سبعة ، أظهر نفس العرض للخلايا المصنفة خلايا إيجابية CD11b. تم استخدام قناة الفلوروفور PE بحجم سبعة لتحديد النمط الظاهري الإيجابي F4 / 80.
وتم تحديد الخلايا الإيجابية الثلاثية على أنها بلاعم قلبية مقيمة. يشار إلى البلاعم القلبية المعزولة المزروعة في الوسط لمدة تصل إلى ستة أيام بسهام بيضاء ، بينما تشير الأسهم السوداء إلى الخلايا الميتة. يمكن استخدام البلاعم المصنفة لمزيد من الدراسات الوظيفية مثل تجارب مشبك التصحيح أو دراسات التعبير مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو الدراسات البروتينية.
