עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (148808 ו- 148792), SE נתמכה על ידי הלב ושבץ קרן, פרס אנשי משרד מחוזי אונטריו, המשפחה, טד רוג'רס מרכז הלב ומחקר של מונק פיטר מרכז הלב. XCC מחזיקה מלגת בנטינג CIHR. LA מחזיקה של הלב & קו/ריצ'רד Lewar Studentship פרס.

אתיקה במשפט: פרוטוקול זה עבר בדיקה וזכה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה אוניברסיטת בריאות ברשת (טורונטו, קנדה), עומדת בדרישות המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים.
1. מאגר הכנה
<ol><li>להכין מאגר HBB (מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), סרום שור חום 2% לא פעיל, 0.2% שור אלבומין). להוסיף 10 מ של חום להשבית סרום שור ו- 1g של אלבומין שור עד 500 מ"ל של HBSS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C.</li>
	<li>הכנת מאגר FACS (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 2% חום להשבית סרום שור, 1 מ Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA, pH 8.0)). להוסיף 10 מ ל חום להשבית סרום שור, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA עד 500 מ"ל ל- PBS. מסנן לחטא דרך מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C. הערה: פתרונות שניתן לאחסן ב 4 ° C עד כחודש.</li>
</ol>2. תוויות של מחזורי לויקוציטים
<ol><li>גילוח ורחיצה כירורגית להכין אנטי-עכבר הזרקת CD45 עם 1 µg של נוגדן מעורבבת עם פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) עבור אמצעי אחסון הזרקת הסופי של µL 200/עכבר. לטעון אמצעי אחסון לתוך מזרק אינסולין 28.5G ולשמור מן האור. הערה: השתמש שני נוגדנים שונים מתויג fluorochrome אנטי-CD45 על מנת להבדיל את קרישה תוך-כלית (מוכתמים דרך העירוי המינהל) ההכתמה intracardiac (מוכתמים לאחר עיכול; ראה שלב 4).</li>
	<li>
לחמם עכברים (בת 8-12 שבועות) על ידי חשיפת הזנב למנורה לחום האדום במשך 5 דקות. התראה: לא לחמם יותר מדי את החיה. לשמור את המנורה במרחק בטוח (> 30 ס מ).<ol>
<li>לרסן את החיה במצב בחזה ובצלעות באמצעות התקן המתאים. לחשוף ולייצב את הזנב עם היד הלא דומיננטית על ידי שיתק בבסיס הזנב עם והאמה ובאזור אמצע-הדיסטלי של הזנב כאשר האגודל הקמיצה. התראה: אין להחיל יותר מדי כוח בקצה הזנב כמו העור יכול להיות הסיר. הכנס את המחט עם שפוע פונה כלפי מעלה המזרק. שמרו את המחט במקביל לוריד בכל עת קל לנקב את הווריד. הערה: דם הזנת את המזרק עלולה להתרחש, סימן של זריקה טובה. כיפוף המחט לזווית 90 מעלות יכול להקל על הניהול עירוי. אשר עם משרדך בטיחות כמו מחטים כיפוף עשוי לייצג סיכון.</li>
		<li>מזריקים לווריד 200 µL לווריד הזנב. הנוזל צריך לזרום בקלות ונקה באופן זמני את הווריד. התראה: אל תדחף בכוח נוזלים אם ההתנגדות. זהו סימן מוזרים של המחט.</li>
		<li>לאפשר נוגדן לזרום למשך 5 דקות לפני בצורה הומאנית המתות חסד העכבר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הלב בידוד ועיכול
<ol><li>
המתת חסד עכברים באמצעות CO2 או על ידי אחרים הליך מקובל כמוסד המתת חסד.
	<ol>
<li>עבור CO2 המתת חסד, מקם את העכבר בתא2 CO ולהגדיר את קצב מילוי 20% נפח החדר לדקה (קרי, אם החדר הוא L 10, מילוי ב- 2 ל'/דקה). לפעול במשך 2 דקות וצג העכבר עד להפסקת נשימה.</li>
		<li>. כבה את ה-CO2 ולא להשאיר את העכבר דק 1-2 נוספים ודא נשימה שחדל לפני פתיחת התא ולבצע קמצוץ הבוהן כדי לאשר שהעכבר מת לפני שתמשיך כדי לעבד את העכבר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לרסס את העכבר עם 70% אתנול. הרם את העור בבטן, לנתח את העכבר על ידי גזירה לאורך תחילת קו האמצע הגחון ברמה של הירכיים עד עצם החזה. לפתוח את הבטן ולהעביר את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת.</li>
	<li>
חותכים את הסרעפת, אז הצלעות משני צידי הקו האמצעי, להיות נזהר שלא ניקב את הריאות והלב.
	<ol>
<li>חושפים הלב על ידי פילינג בחזרה את הצלעות, ואז לחתוך קודם אטריה שמאל ואחריו אטריה נכון. התראה: שימוש באזהרה בעת חיתוך אטריה, המבטיח שאין עורקים או ורידים נפצעים, כמו זה יכול להפחית את היעילות של שטיפה הדם הכלול האברים.</li>
		<li>Perfuse את הלב עם 15-20 מ"ל של PBS קר באמצעות מזרק 60 מ ל מצויד עם מחט 21 G, PBS קר. בעדינות לתפוס את הבסיס של הלב עם מלקחיים והכנס את המחט לתוך החדר השמאלי ליד השיא. חזור על הפעולות של החדר הימני. זריקה נכונה גורמת לבן הריאות והכבד חיוור. הערה: זלוף צריכה להתבצע בתוך 5 דקות לאחר המתת חסד כדי למנוע קרישת דם, אשר יכול לזהם את האיברים של עניין עם מחזורי תאים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להחזיק את הבסיס של הלב עם מלקחיים, בעדינות תמשוך את הלב ולאחר מכן לנתק את הלב על ידי חיתוך ועורק הריאה ראשי ואת הוורידים, העורקים השק סביב הלב.
	<ol>
<li>לנקות את הלב על-ידי בעדינות החזקת את הלב בין האגודל לבין האצבע במגבת נייר נקייה נטולת ומשוך את אטריה, שרידים של העורקים הראשיים, ורידים, כל מזהמים אחרים עם מלקחיים. הערה: ודא מכלול של אטריה מוסר אין רקמות אחרות, כגון הריאות או כלי דם, קיימים כמו רקמות אלו יש תאים חיסוניים תושב משלהם. הריאה בפרט יש אוכלוסיה תאים חיסוניים גדולים זה יכול להסוות את אוכלוסיות קטנות יותר של אלה בתוך שריר הלב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מקום בלב בצלחת פלסטיק 5 ס מ עם µL 50 ל- PBS קר.
	<ol>
<li>מינצ הלב באמצעות מספריים ויבתר מעוקל עד אין כלים גלוי, יש עקביות חלקה. הערה: לנסות לשמור על הלב באזור כלולות של המנה במהלך קוצץ כדי למזער את איבוד רקמות.</li>
		<li>העברת רקמות thetrituratedheart באמצעות מלקחיים מעוקל לתוך צינור microcentrifuge 2 מ עם 800 µL קר Dulbecco של שינוי נשר בינוני (DMEM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להוסיף ofcollagenase U/mL 450 אני 60 U/mL של hyaluronidase סוג אני-S, 60 U/mL של DNase-את כל דגימה.
	<ol>
<li>דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על מטרף נדנדה ב-50 סל ד למשך 45-60 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לאחר עיכול, בקצרה דוגמאות מערבולת (20 s) ומניחים מיד על קרח כדי לשמור דגימות על 4 מעלות צלזיוס.
	<ol>
<li>באמצעות pipettor של 1 מ"ל, פיפטה דגימות למעלה ולמטה עד דגימות רקמה הומוגנית, לא לסתום את הטיפ פיפטה. הערה: הגדרת מספר מסוים של פעמים על פיפטה עשוי להגביר הפארמצבטית. אם הלבבות לא מתעכל בצורה אופטימלית, חתיכות של שריר הלב עלול להכשיל את פיפטה. טחינת בעדינות את הטיפ פיפטה נגד הצינור microcentrifuge יעזור homogenize גדול יותר חתיכות רקמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
טרום רטוב מסננת תא 40 µm המוטלות על צינור חרוטי 50 מ עם 1 מ"ל של HBB קר.
	<ol>
<li>הוסף מדגם הומוגני את המסנן ' לשטוף דרך מאת לאט למזוג 12 – 14 מ ל HBB קר.</li>
		<li>העברת דגימות מסוננים צינור חרוטי שכותרתה 15 מ"ל ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C. תשאף את תגובת שיקוע.
	<ol>
<li>Lyse כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת 1 מ"ל אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר כל דגימה. Resuspend דגימות מאת vortexing, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.</li>
		<li>לאחר פירוק השלימה, להוסיף 5-8 מ"ל מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק קר) להפסיק המוליזה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות-gfor 400 x דקות 5-4 מעלות צלזיוס. תשאף את תגובת שיקוע.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל FACS מאגר כל דגימה של העברת צינור microcentrifuge mL 1.5 עם תוויות ברורות. הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן עבור עד 2 שעות עם דגימות המאוחסנים ב 4 º C.</li>
</ol>4. לזרום Cytometry מכתים וניתוח
<ol><li>
צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
	<ol>
<li>להפחתת נוגדנים שאינם ספציפיים מחייב, לדלל מטריים anti-CD16/CD32, מונוציט חוסם הפריטים המוקפצים (1:20) חשבונאות (ראה טבלה של חומרים) עבור 50 FACS µL עבור דגימה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.</li>
		<li>להכין את הנהלת דילול (1:250 עבור כל נוגדן) נוגדנים עבור 50 µL של FACS לדגימה. הערה: צבע הכדאיות יכולות להיכלל הנוגדן קוקטייל כדי לא לכלול תאים מתים. לחלופין, גודל קטן מהכלל על-ידי ניתוח תזרים יכול להיות משומש (איור 1C ו- D).</li>
		<li>בלי כביסה, להוסיף 50 µL של מיקס מאסטר נוגדן אחד לטעום ולערבב.</li>
		<li>דגירה בדגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 600 µL FACS כל מדגם לשטוף את צנטריפוגה דגימות ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend צנפה ב- 300 µL FACS. לשמור דגימות ב 4 ° C בחושך. הערה: צבעי הכדאיות מסוימים, כגון דאפי, לדרוש מכתים בתוך 10 דקות לפני הפעלת cytometry זרימה.</li>
	<li>לנתח ידי cytometry זרימה (ראה דמויות 1 ו- 2) בתוך ה 3 הבא. אם זמן רב יותר הוא נדרש, קצר טווח קיבוע באמצעות paraformaldehyde של ריכוז נמוך (0.5-1% ב- PBS) מומלץ לשמר מכתים. הערה: מומלץ לסנן דגימות דרך מסננת תא 40 µm לפני ניתוח cytometry זרימה אתחול כדי למנוע שיבוש פלואידיקה של cytometer הזרימה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דלקת שריר הלב, או דלקת שריר הלב, היא תכונה של מחלות לב וכלי דם ביותר. עם זאת, שריר הלב אינו נטול משלו רכיבי מערכת החיסון במצבים שאינם מחלת. במהלך מצב יציב, תאים חיסוניים רבים שוכנים בשריר, לגלם את התפקידים החיוניים של תחזוקה והגנה. אפיון אלה אוכלוסיות מגוונות של תאים לא היה אפשרי ללא שיטות כמו...

צורות שונות של מתח שריר הלב או פציעה, כולל איסכמי (פגיעה reperfusion איסכמיה או אוטם שריר הלב) ואיסכמי (יתר לחץ דם או דלקת שריר הלב), לקדם הגיוס של תאים דלקתיים עם תיקוני ומגונן, אבל גם מאפייני פתוגניים. מוקדם ככל 1891, רומברג תיאר לראשונה את הנוכחות של תסנין התאית בשריר של חולים שנדבקו עם טיפוס ועוד השנית1. עם זאת, המחקר מפורט של תאים חיסוניים לב נדרש הפיתוח של טכניקות מתקדמות יותר immunophenotyping. כתוצאה מכך, רק לאחרונה התחלנו להבין כי אוכלוסיה מגוונת של תאים חיסוניים עם תחזוקה חיוני תפקידים במהלך מצב יציב שוכן בתוך שריר הלב.
היסטולוגיה היה, והוא עדיין, השיטה הנפוצה ביותר כדי לאפיין את תאי מערכת החיסון לב בעת דלקת. עם זאת, בעוד היסטולוגיה מייצג כלי אבחוני חשוב, השימוש במחקר של תאי מערכת החיסון לב יש מגבלות חשוב. תאים חיסוניים המתגוררים שריר הלב מייצג חלק קטן מאוד של התאים הכולל ומופצים פחות או יותר באופן שווה בחלל העצום באופן פרופורציונלי. באופן דומה, כמה צורות של דלקת לב, כגון נגיפי דלקת שריר הלב, להציג דפוסים מוקד של דלקת. משמעות הדבר היא כי ניתוח מדויק של המערכת החיסונית של הלב דורשים לעיתים קרובות גבוהה יותר מעלות של דגימה היסטולוגית, הגדלת העלות לצמצם הטיה. יתר על כן, היסטולוגיה מספק כמות מוגבלת מאוד של מידע שימושי בזיהוי תא (למשל מספר פרמטרים). עם מספר גדל והולך של תת-ערכות תא מחייבות השימוש של מספר סמני ביטוי (כולל סמני פני השטח, גורמי שעתוק או על ידי מולקולות), cytometry זרימה ביססה את עצמה בתור הכלי החזק ביותר עבור immunophenotyping, בשל בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה.
השימוש בטכניקות immunophenotyping תלויה בשיתוף פעולה הדוק לפיתוח פרוטוקולים לעיכול יעיל המותר עבור ניתוח חד-תאים של מספר גדול של תאים. הפיתוח של הפרוטוקולים ממצה של מיצוי תא נפתח חלון חדש של הזדמנויות במחקר של הלב אימונולוגיה. באמצעות השילוב של מערכת העיכול, cytometry זרימה transcriptomics, האוכלוסיות הגדולות של מקרופאגים, תאים דנדריטים ששוכן בלב היה מאופיין2,3. האוכלוסייה הנפוץ ביותר של תאים חיסוניים הלב במהלך מצב יציב הן CD64+MerTK+ מקרופאגים, אשר ניתן לחלק נוספת המבוססת על הבעת רגשותיהם CCR2 או CD11c2. CCR2+ מקרופאגים שמקורם במח העצם למבוגרים hematopoiesis, בעוד הרוב המכריע של CCR2– מקרופאגים, אשר יכולים לבטא רמות גבוה או נמוך של MHC-II, הם בעיקר ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים לבצע פונקציות מפתח כגון תיקון4 ופינוי פסולת5 במהלך פציעה או תמיכה קישוריות חשמלי6 במצב יציב. במהלך צורות שונות של דלקת זרם חשוב של Ly6Cשלום MHC-IIהלאו CD64int ומונוציטים להתרחש, אשר מאוחר יותר להבדיל לתוך Ly6Cשלום CCR2+ מקרופאגים2,7 . אוכלוסיה קטנה יותר באופן משמעותי, אבל חשוב, של תאים המתגוררים שריר הלב של אנשים בריאים מורכב של תאים דנדריטים8,9. שני תת-קבוצות העיקריים של הלב בקרי קבוצת מחשבים קונבנציונלי (cDCs) אפיינו היה לאחרונה: cDC1 (CD103+ DCs), cDC2 (CD11b+ בקרי קבוצת מחשבים). DCs לשחק תפקידים חשובים בהגנה נגד זיהום8 , אך יכול גם לקדם פגיעה עצמית בעת דלקת, במיוחד במהלך אוטם שריר הלב9.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של קיימא תאים חיסוניים הלב מן העכבר שריר הלב. השיטה משלבת עיכול אנזימטי ועל מכניים עם סינון תא-מסננת כדי לקבל השעיה תא בודד שניתן לנתח, או עוד יותר טהור, על ידי מיון cytometry זרימה או חרוז מגנטי העשרה. מדידות מדויקות של תאי שריר הלב extravascular דורשות זלוף הלב כדי להסרת לכלוך אפשרי מזרם הדם של microvasculature הלב. בנוסף, אנו מציגים שלב אופציונלי של קרישה תוך-כלית תיוג של תאים חיסוניים יכול לשמש כדי נוספות להבדיל תאי שריר הלב מזהמים קרישה תוך-כלית, המבוסס על פרוטוקול et al. Galkina10. לבסוף, אנו מציגים ניתוח cytometry זרימה בסיסיים כדי לזהות את subpopulations הגדולות מקרופאג ו- cDC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

המערכת החיסונית היא מרכיב חיוני של לב בריא. שריר הלב הוא ביתם של אוכלוסיה עשירה של תאים חיסוניים שונים תת-ערכות עם תפקודי מידור במהלך מצב יציב ובמהלך צורות שונות של דלקת. עד לאחרונה, המחקר של תאים חיסוניים בלב הצריכו השימוש במיקרוסקופ או פרוטוקולים עיכול לקוי מפותחת, אשר סיפקה מספיק רגישות בזמן דלקת חמורה אבל לא היו מסוגלים בביטחון לזהות קטן — אבל מפתח – אוכלוסיות של תאים במהלך מצב יציב. כאן נדון שילוב של שיטה פשוטה אנזימטי (collagenase, hyaluronidase ו- DNAse) ועיכול מכני מאתר לבבות ולפניהם קרישה תוך-כלית מינהל מתויג fluorescently נוגדנים להבדיל קטן אבל בלתי נמנע קרישה תוך-כלית תא מזהמים. שיטה זו יוצרת השעיה של מבודד התאים קיימא שניתן נותחו על ידי cytometry זרימה עבור phenotyping וכימות, או מטוהרים נוסף עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון או הפרדה מגנטית חרוז לימודי ניתוח או במבחנה תעתיק. אנו כוללים דוגמה של ניתוח cytometric זרימה צעד אחר צעד כדי להבדיל בין מקרופאג מפתח אוכלוסיות תאים דנדריטים של הלב. עבור ניסוי בגודל בינוני (10 לבבות) השלמת ההליך מחייב h 2-3.

נכון להיום, אין שיטה טובה תוכנן כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים מרכיבי התא הלב, כגון cardiomyocytes. לפיכך, ניתוח של התליה תא בודד הלב מאת cytometry זרימה דורש מראש-gating עם CD45 כדי לזהות את אוכלוסיות תאים חיסוניים, ואחריו תא בודד, גודל קטן אי-הכללה של חסימה (איור 1א'</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Views.  University Health Network (UHN). פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

Video: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...