وأيد هذا العمل من قبل شركة ميرك UNCF - زمالة دراسات عليا بحوث العلوم أطروحة (JLM) ، القومي للقلب والرئة والدم المعهد منح RO1 - HL - 62228 (JSJ) وRO1 - HL - 073990 (JSJ).

1. إعداد هانكس &quot;الرصيد محلول الملح (HBSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف L 1 كوب الزجاج ، وتخرج 1000 مل اسطوانة ، ويحرك الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الحل مسحوق HBSS تعقيمها في دورق زجاج 1 لتر إلى 900 مل علامة مع الماء المقطر مزدوجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج حل HBSS مع 3.4 غرام من الملح + Hepes الصوديوم وضبط درجة الحموضة إلى قيمة بين 7،35-7،41 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو تتركز HCL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة قد تحقق المطلوب ، ودرجة الحموضة لا تزال مستقرة ، إضافة 5 غ من ألبومين المصل البقري إلى حل في درجة حرارة الغرفة حتى يذوب تماما الزلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من الماء المقطر والمضادات الحيوية ، antimyotic ، إلى الحل وحتى مضاعفة حجم إجمالي في علامة مل 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك حل شامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية حل HBSS وفصلها إلى 50 مل أنابيب فالكون لاستخدامها لاحقا. يمكن تجميد أنابيب إضافية واستخدامها في وقت لاحق. </li></ol> 2. محضرات الحيوانن -- إدراج أنبوب القصبة الهوائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصكوك اللازمة مع الدرج والمادية من أجل إدخال أنبوب القصبة الهوائية (أي ملقط ، مقص ، وأنبوب القصبة الهوائية ، 3-0 مضفر خياطة سوداء صغيرة التنفس الحيوانية ، الخ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم تخدير الفئران تماما مع كوكتيل الكيتامين / زيلازين في نسبة 2 إلى 1 زيلازين الكيتامين ، حلق البطن والصدر ، والحنجرة من الفئران. للتأكد من أنه تم التوصل إلى حالة تخدير عميق ، قرصة اصبع الفأر والاختيار للانسحاب من دواسة أطرافهم. تأكد من الفئران هو تخدير بعمق قبل اتخاذ جميع الشقوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الفأر مع رئيسها الذي أثير حول قطع المجلس الذي يميل بزاوية 30 درجة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الجلد من منتصف البطن إلى أسفل الفك السفلي. بعيدا تشريح عضلات المثلث الأمامي من الرقبة لفضح القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3-0 وضع مضفر خياطة سوداء تحت القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في القصبة الهوائية بين الحلقات الغضروفية anد إدراج أنبوب القصبة الهوائية. ربط الخيط بإحكام لتأمين أنبوب القصبة الهوائية إلى القصبة الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب القصبة الهوائية لجهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة. </li></ol> 3. إعداد أداة لعزل الخلايا المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير صينية مع الأدوات اللازمة لإجراء زنزانة انفرادية المناعي (أي ملقط ، مقص ، HBSS ، قلص لينة تفلون قياس 24 باكستر داخل الأوعية الدموية خلال إبرة سريعة القسطرة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد two المحاقن 10cc ، ملء أحد المحاقن مع HBSS على عرضه العازلة في كيس التامور والاحتياطي الآخر لالشفط الخلايا التي تحتوي على HBSS. 3.2.1. تقليل تفلون غيض من داخل الأوعية قياس باكستر 24 خلال إبرة سريعة القسطرة (الطول 1.6) بنسبة 2 / 1 إلى 3 / 4 من طوله الأصلي لإجراء العزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل مكان الحقن ، ومخازن ، وفارغة 15 مل أنبوب فالكون (للاحتفاظ السوائل المستخرجة بمجرد الانتهاء من الإجراء) على الجليد. </li></ol> &lt;ع = فئة &quot;jove_title&quot;&gt; 4. المناعي زنزانة انفرادية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط في جدار البطن (على طول الخط ألبا) حتى تصل إلى عملية الخنجري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا قليلا أفقيا لعملية الخنجري ، وجعل الشقوق بين البلدين من خلال القفص الصدري استمرار بزاوية نحو الإبطين. يجب الحرص على عدم خرم الرئتين والقلب ، أو بيريكارديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في شقوق على جانبي القص كاملة ، بعيدا تشريح الحجاب الحاجز السفلي من أضلاعه ، وقطع الأطراف إلى الإنسي. ملاحظة : كن على علم من أي وقت مضى حيث يتصل بيريكارديوم الحجاب الحاجز والقص لتجنب الضرر. استخدام الرباط المنجلي كمعلم لاحظ حيث يتم إرفاق تأمور على الجانب الآخر من الحاجز. أيضا ، إذا تم خفض تأمور ، يتم فقدان القدرة على عزل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف جانب واحد من القفص الصدري لكشف التجويف الصدري والقلب (التي لا تزال مغلفة بيريكارديوم).</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ حقنة مليئة HBSS وايجاد نقطة في كيس التامور تقريبا إلى نصف الطريق بين القص والقلب (ويفضل أكثر من منقاري الذيلية) ، وإدراج غيض من تفلون تقصير السريعة سواء عن طريق القسطرة طبقات بيريكارديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة القسطرة في مكانها ، والمضي قدما بلطف ملء الفراغ مع تأموري 2-3 مل من HBBS العازلة. ستعرف على الفور إذا تم وضعها بشكل صحيح القسطرة عندما تلاحظ المساحة تأموري التوسع. إذا لم يشهد تعبئة والانسحاب وإعادة عملية قسطرة سريعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يملأ الكيس التأموري ، يأخذ حقنة أخرى 10 سم ومكان الطرف الخلفي في تأمور الشفط وتبدأ المخزن المؤقت. ويمكن استخدام فتحة دخول نفسه أو يمكن أن تنشأ آخر. تأكد من وجود طرف لا يأتي قريبا جدا من جدران كيس التامور مع توفير الشفط ، وخاصة على الجانب السفلي من القلب. وهذا يمكن أن يؤدي إلى ثقب كيس التامور وفقدان الخلايا التي تحتوي على خليةس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما الشفط المنطقة العازلة ، يمكن نقل معلومات سرية حول القسطرة داخل كيس التامور من أجل جمع العازلة قدر الإمكان. </li></ol> ملاحظة : إذا كنت في ذلك المسيل للدموع قليلا تأمور وجعل ثقب في الجزء العلوي من القلب أكبر من ثقب الأصلي ، لا داعي للذعر. ما دام لا يزال يحيط بما فيه الكفاية تأمور القلب يمكنك القيام اخرى لا تزال على غسل القلب ولكن مع أقل كمية العازلة. لجمع مبلغ الأمثل للخلايا ، وهناك حاجة إلى 3-4 يغسل إضافية. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان المخزن في استخراج أنابيب فالكون التي تم وضعها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القلب والرئتين ، و / أو أي نوع من الأنسجة الأخرى إذا دعت الحاجة لمزيد من الدراسات. بعد مجموعة من الخلايا المناعية والأنسجة الأخرى ، يجب أن تكون الفئران بسرعة والموت الرحيم إنسانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لجمع عينات من الخلايا المناعية لمدة 10 دقيقة في 200G في 4 درجات مئوية. دائما الأنابيب على الجليد<html> عندما لا تكون قيد الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وإعادة تشكيل طاف بيليه في 1 مل من الاحتياطي Hyclone أو HBSS. </li></ol> ملاحظة : من المهم لحساب عدد الخلايا المناعية التي تم الحصول عليها من كل القلب بعد إجراء زنزانة انفرادية المناعي. 5. ممثل النتائج : يتم تقديم مثال على عزل الخلايا البدينة القلب حصلت مع هذه التقنية والملون باللون الأزرق وطولويدين safranin O / الزرقاء alcian في الأرقام و2A 2B ، على التوالي. كما يمكن أن يرى في الشكل 3 ، سارية القلب ، والحفاظ على قدرتها على إطلاق الهستامين بعد العلاج مع تفعيل المعروفة مثل مجمع 48/80 و ف الجوهر كما هو موضح في مورغان وآخرون 9 المؤامرات مبعثر الممثل من التدفق الخلوي لخلايا CD4 + و وتعرض خلايا CD8 + في أرقام 4 و 5 على التوالي. ويتم تحديد المزيد من اللمفاويات التائية وphenotyped باعتبارها الخلية من سكان هذه التقنية. ق ق = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig1.jpg" /> الشكل البياني للتدفق 1. القلب من الخلايا المناعية إجراء العزل. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig2.jpg" /> هي ملطخة الرقم 2 صور ممثل النسيجي للخلايا البدينة القلب على النحو التالي : (أ) مع الأزرق طولويدين و (ب) هي safranin O / الزرقاء alcian. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig3.jpg" /> الشكل 3. دراسة وظيفية من الخلايا البدينة القلب معزولة عن المنطقة وتحفيز عضلة القلب epicardial مع مجمع 48/80 (10μg/mL) و ف مادة (10μM). <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig4.jpg" /> الشكل 4. الممثل المؤامرات مبعثر التدفق الخلوي لخلايا CD4 + معزولة المسمى مع ف مادة (1:100 مخففأيون). <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3020/3020fig5.jpg" /> الشكل 5. الممثل التدفق الخلوي من عزل خلايا CD8 + المسمى مع ف مادة (1:100 التخفيف).

<ol>
	<li>Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cause+and+effect+relationship+between+myocardial+mast+cell+number+and+matrix+metalloproteinase+activity.">Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).</li><li>Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacologic+inhibition+of+mast+cell+degranulation+prevents+left+ventricular+remodeling+induced+by+chronic+volume+overload+in+rats.">Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats.</a> Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).</li><li>Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mast+cell-mediated+activation+of+gelatinase+and+alteration+of+ventricular+diastolic+function.">Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).</li><li>Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+adverse+myocardial+remodeling+secondary+to+chronic+volume+overload+in+mast+cell+deficient+rats.">Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).</li><li>Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Mast+Cells+Mediate+Left+Ventricular+Fibrosis+in+the+Hypertensive+Rat.">Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat.</a> Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).</li><li>Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+pro-inflammatory+cytokine+production+and+peritoneal+macrophage+function+in+rats+with+chronic+heart+failure.">Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure.</a> Cytokine. 34, 284-290 (2006).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+Cells:+Versatile+regulator+of+inflammation,+tissue+remodeling,+host+defense+and+homeostasis.">Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis.</a> Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).</li><li>Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+expression+of+inflammatory+cytokines+and+activation+markers+in+T-cells+from+patients+with+chronic+heart+failure.">Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure.</a> Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).</li><li>Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiologically+Relevant+Concentrations+of+Tumor+Necrosis+Factor-&#x0251;+Promote+Progressive+Left+Ventricular+Dysfunction+and+Remodeling+in+Rats.">Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-&#x0251; Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats.</a> Circulation. 97, 1382-1391 (1998).</li><li>Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+Cardiac+Mast+Cells+Degranulate+and+Release+Preformed+TNF-&#x0251;,+Initiating+the+Cytokine+Cascade+in+Experimental+Canine+Myocardial+Ischemia/Reperfusion.">Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-&#x0251;, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion.</a> Circulation. 98, 699-710 (1998).</li><li>Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-&#945;+inhibition+attenuates+adverse+myocardial+remodeling+in+a+rat+model+of+volume+overload.">TNF-&#945; inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).</li><li>Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+histamine+secretion+during+isolation+of+rat+cardiac+mast+cells.">Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells.</a> Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).</li><li>Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sympathetic+nervous+system+modulation+of+inflammation+and+remodeling+in+the+hypertensive+heart.">Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart.</a> Hypertension. 55, 270-276 (2010).</li><li>Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+isolating+functional+mast+cells+from+the+heart.">A novel technique for isolating functional mast cells from the heart.</a> Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

<html> هذا الأسلوب من عزل الخلايا المناعية القلب تمكن من تحليل وظيفتها ، النمط الظاهري ، والنضج دون تفعيل غير المرغوب فيها التي تحدث عادة خلال التقليدية الأنزيمية الهضم تقنية العزل. متوسط ​​العدد الكلي للخلايا التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب هو حوالي 400،000 في قلب فأ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف والمعدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> هانكس &quot;سولت المتوازن </td><td> سيغما </td><td> H4891 </td><td> زجاجة واحدة يجعل من الملح 1 لتر ميزان هانكس &quot; الحل. سولت لإعادة التوازن هانكس &quot; الحل كجزء من هذا الإجراء. </td></tr><tr><td> مضادات الحيوية Antimyotic </td><td> Gibco </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيغما </td><td> H3784 </td><td></td></tr><tr><td> مصل بقري الزلال </td><td> سيغما </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> زجاجة 250 مل Nalogene تصفية </td><td> Thermoscientific </td><td> 157-0020 </td><td></td></tr><tr><td> N 12 HCL </td><td> فيشر العلمية </td><td> CAS 7647-01-0 </td><td> لمدة 6 N ، إضافة وحدات متساوية من HCL لمنزوع الأيوناتالمياه. </td></tr><tr><td> 10 N هيدروكسيد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية </td><td> SC267 </td><td> لمدة 5 N ، إضافة وحدات متساوية من هيدروكسيد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات. </td></tr><tr><td> الماء المقطر المزدوج </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> جدول معدات محددة : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف والمعدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 3 - O خياطة الحرير مزين </td><td> Ethicon المنتوجات </td><td> SA64H </td><td></td></tr><tr><td> مروحة صغيرة الحيوان </td><td> CWE إنكوربوريتد </td><td> SAR - 830 </td><td> تعيين معدل التنفس إلى 40.5 الأنفاس لكل دقيقة. </td></tr><tr><td> إبرة قياس 18 شطبة </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 305199 </td><td> تقليم إبرة بنسبة 2 / 1 إلى 3 / 4 من طوله الأصلي للاستخدام أنبوب القصبة الهوائية و. </td></tr><tr><td> تلميح تفلون (مع إزالة الإبرة) من قياس 24 - قسطرة سريعة القسطرة باكستر </td><td> باكستر </td><td> 2N111 </td><td> تقليل طول تلميح تفلون بنسبة 2 / 1 إلى 3 / 4. </td></tr><tr><td> 10 سم حقنة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-823 - 16B </td><td></td></tr><tr><td> 15 مل فالكون أنابيب </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall جهاز طرد مركزي في برادات RT6000B </td><td> فيشر العلمية </td><td> 75-004-377 </td><td> تذكر لتبريد المسبق والاحتفاظ في 4 درجات مئوية. </td></tr><tr><td> Hyclone </td><td> Thermoscientific </td><td> S300030.02 </td><td></td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td><td> Hausser العلمية </td><td> HS - LB - 1483 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of functional cardiac immune cells

الخلايا المناعية القلب تكتسب الفائدة على الدور الذي تلعبه في تغيير بنية مرضية في العديد من أمراض القلب 1-5 هذه الخلايا المناعية ، والتي تشمل الخلايا البدينة ، وخلايا تي الضامة ؛ تخزين وإطلاق مجموعة متنوعة من الوسطاء بما في ذلك النشطة بيولوجيا والسيتوكينات وقد ثبت البروتياز مثل تريبتاز 6-8 هؤلاء الوسطاء أن اللاعبين الرئيسيين في عملية الأيض المصفوفة خارج الخلية من خلال تفعيل metalloproteinases مصفوفة أو التسبب في تراكم الكولاجين بواسطة وظيفة القلب الليفية &quot;تحوير 9-11 ومع ذلك ، التقنيات المتاحة لعزل الخلايا المناعية والقلب كانت مشكلة لأنها تستخدم كولاجيناز البكتيرية لهضم أنسجة عضلة القلب. هذا الأسلوب يؤدي تنشيط الخلايا المناعية وبالتالي فقدان وظائف. وضعنا على سبيل المثال ، تصبح الخلايا البدينة القلب بشكل ملحوظ أقل استجابة للمركبات التي تسبب تحبب (12). لذلك ، وهي تقنية تسمح للرانه عزل خلايا وظيفية قلبية المناعية التي من شأنها أن تؤدي إلى فهم أفضل لدور هذه الخلايا في أمراض القلب. 13 ، 14 يتطلب هذا الأسلوب في ألفة مع المكان التشريحي للفأر الخنجري الإبطين ، وعملية الرباط المنجلي ، وتأمور القلب. هذه هي معالم هامة لزيادة نجاح العملية وضمان عائدات أعلى من الخلايا المناعية في القلب. ويمكن بعد هذه الخلايا المناعية القلب المعزولة أن تستخدم لتوصيف النمط الظاهري ، وظائف ، والنضج ، وشارك في التجارب مع ثقافة خلايا القلب وغيرها للحصول على فهم أفضل لتفاعلاتها.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Functional Cardiac Immune Cells at JoVE.com

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

هذا الأسلوب لعزل الخلايا المناعية وظيفية من القلب ويوفر بديلا للأساليب التقليدية للكولاجيناز الهضم ، والذي يسبب تنشيط الخلايا المناعية غير المرغوب فيها ، مما أدى إلى انخفاض في استجابة هذه الخلايا. لدينا وسيلة لعزل الخلايا المناعية وظيفية غلة القلب عن طريق تجنب المشاكل المرتبطة الهضم الأنزيمي.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

isolation-of-functional-cardiac-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K Views.  University of South Carolina- School of Medicine. هذا الأسلوب لعزل الخلايا المناعية وظيفية من القلب ويوفر بديلا للأساليب التقليدية للكولاجيناز الهضم ، والذي يسبب تنشيط الخلايا المناعية غير المرغوب فيها ، مما أدى إلى انخفاض في استجابة هذه الخلايا. لدينا وسيلة لعزل الخلايا المناعية وظيفية غلة القلب عن طريق تجن?...

Video: Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

سبع خطوات لخلايا النجمية

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

عزل تدفق Cytometric من نوع خلايا الفئران الابتدائية السنخية II طلائي للدراسات الوظيفية والجزيئية

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

العزلة من الأنسجة الدهنية خلايا المناعة

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

عزل وتوصيف والفحص الوظيفي لشبكة خلية اللثة المناعي

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

عزل وتوصيف المجهرية الدقيقة المستمدة من العَدلات للدراسات الفنية

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...