يمكن أن تساعد هذه الطريقة على إنتاج كميات كبيرة من RNAs المؤتلفة ذات الفائدة للتطبيق في مجال البحث أو الصناعة. الميزة الرئيسية هي أن يتم إنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في Escherichia القولونية في عملية رخيصة التي يمكن توسيعها بسهولة. الأهم من ذلك، يتم إنتاج الجيش الملكي النيبالي على سقالة RNA دائرية، مما يسهل تنقية إلى التجانس.
وعلى النقيض من الحمض النووي أو البروتينات، لا يتم إنتاج الحمض النووي الريبي النووي الذي يهمه بسهولة بكميات كبيرة في النظم الحيوية، مثل ثقافة الإشريكية القولونية. ويستند أسلوبنا على التعبير المشترك من الجيش الملكي النيبالي من الفائدة إدراجها في سقالة دائرية مستقرة للغاية وتطبيق الرباط الذي يتوسط تعميم الجيش الملكي النيبالي. السقالة RNA التعميم مستمدة من viroid براءة اختراع.
Viroids هي صغيرة نسبيا، غير ملفوف، RNAs قاعدة عالية الاقتران التي هي المعدية لبعض النباتات أعلى. يمكننا إنتاج عشرات ملليغرام من الحمض النووي الريبي المؤتلف لكل لتر من الثقافة البكتيرية في ظروف المختبر العادية. لبدء هذا الإجراء، تضخيم cDNA بواسطة PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد ذلك، أضف 100 نانوجرام من pLELVd-BZB إلى أنبوب 0.5 ملليلتر. إضافة 10 يو من نوع IIS إنزيم تقييد BpiI و ما يكفي من G العازلة لإنشاء رد فعل ميكرولتر 20. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم البلازميد.
بعد هذا، فصل PCR ومنتجات الهضم عن طريق الكهرباء في هلام agarose واحد في المئة في عازلة TAE. وصمة هلام عن طريق هزه في بروميد ethidium 200 ملليلتر بتركيز 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. باستخدام transilluminator الأشعة فوق البنفسجية، تصور الحمض النووي.
استخدام مشرط لقطع العصابات المقابلة لcDNA تضخيم وBpiI هضم plasmid. باستخدام أعمدة هلام السيليكا، elute DNAs من شظايا هلام. كمّيّ تركيز الحمض النووي بواسطة التحليل الطيفي.
إعداد رد فعل الجمعية جيبسون باستخدام cDNA تضخيم وplsmid هضمها. احتضان في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، استخدم عمود هلام السيليكا لتنقية رد الفعل.
بعد electroporating المختصة E.coli DH5-ألفا الخلايا، واختيار العديد من المستعمرات البيضاء ونقلها إلى السائل LB المتوسطة. تنمو المستعمرات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم مجموعة صغيرة لتنقية البلازميدات ، وتحليل أحجامها بواسطة الكهرباء في هلام agarose واحد في المائة في عازلة TAE.
أولاً، شارك في نقل الكهرباء سلالة الإشريكية القولونية المختارة مع كل من مشتق pLELVd-BZB الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي (cDNA) المقابل للرنا الرنا ذات الاهتمام وp15LTRNISM للمشاركة في التعبير عن الباذنجان tRNA LIGAse. نقل SOC المتوسطة السائلة في cuvette الكهربائية لاستعادة الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، لوحة البكتيريا على LB المتوسطة الصلبة التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين، و 34 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول.
احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة 250 ملليلتر من السل السائل المتوسطة، التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين، و 34 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول، إلى لتر واحد حيرة قارورة إرلينماير. استرداد E.Coli المحتضنة، ومن ثم اختيار مستعمرة وتطعيم المتوسطة في القارورة.
احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي في 180 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة قبل حصاد البكتيريا. صب ثقافة E.Coli المحصودة في زجاجة جهاز طرد مركزي 250 ملليلتر وتدور أسفل الخلايا في 14، 000 G لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبر و resuspend الخلايا في 30 ملليلتر من الماء.
نقل هذا التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي، وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى باستخدام الشروط السابقة. تجاهل عظمى وإضافة 10 ملليلتر من عازلة الكروماتوغرافيا إلى بيليه الخلية. دوامة لإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت.
إضافة حجم واحد من الفينول: الكلوروفورم ودوامة بقوة لكسر الخلايا. ثم، الطرد المركزي في 12،000 G لمدة 10 دقائق. استعادة المرحلة مائي، إضافة حجم واحد من الكلوروفورم، ودوامة بقوة.
جهاز طرد مركزي في 12،000 G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتصفية إعداد الحمض النووي الريبي من خلال فلتر حقنة ميكرومتر 45. تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام ميلليلتر ثنائي الإيثانول أمين العمود متصلة نظام الكروماتوغرافيا السائل.
اضبط معدل التدفق إلى ملليلتر واحد في الدقيقة، وقي التوازن في العمود مع 10 ملليلترات من عازلة الكروماتوغرافيا. ثم، قم بتحميل العينة وغسل العمود بـ 10 ملليلترات من عازلة الكروماتوغرافيا. Elute الجيش الملكي النيبالي مع 20 ملليلتر من العازلة elution، وجمع aliquots ملليلتر واحد.
باستخدام ثنائي الأبعاد polyacrylamide جل الكهرباء، وفصل RNAs التعميم من نظرائهم الخطية. أولاً، إعداد هلام بوليكريلاميد خمسة في المئة في العازلة TBE وتحتوي على ثمانية اليوريا الضرس كما هو مبين في بروتوكول النص. مزيج 20 ميكرولترات من الاستعدادات RNA مع حجم واحد من العازلة التحميل.
احتضان في 95 درجة مئوية في كتلة التدفئة لمدة 1.5 دقيقة، ومن ثم المفاجئة باردة على الجليد. تحميل العينات في هلام polyacrylamide وتشغيل الكهرباء في الظروف المناسبة لبعد هلام. بعد ذلك، وصمة عار في هلام 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر بروميد ethidium لمدة 15 دقيقة.
غسل الجل الملون بالماء، ومن ثم تصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. التحليل الكهربائي لعدة plasmids المؤتلف الذي يتم إدراجها cDNAs مختلفة تظهر الهجرات المختلفة بالمقارنة مع pLELVd-BZB. لاحظ أن pLELVd-BZB يحتوي على علامة lacZ، والتي يتم استبدالها بـ cDNA المقابلة لـ RNA من الفائدة، لذلك بينما تعتمد الترحيل على حجم cDNA المدرجة، فإن plasmids المؤتلفة عادةً ما يتم ترحيل أسرع من بلازميد التحكم.
يتم رصد إنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في الثقافات البكتيرية المشتركة من خلال كسر الخلايا وتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق DENATURING PAGE. يمكن رؤية نطاقات قوية ، والتي تتوافق مع أشكال ELVd وchimeric ELVd الفارغة ، والتي تم إدراج RNAs مختلفة من الفائدة. ومن المثير للاهتمام، وينظر إلى جزء كبير من الحمض النووي الريبي المؤتلف على أنه شكل دائري.
ويلاحظ أن اتّراء الكسر الرئيسي هو استخدام مزيج من اثنين من PAGEs في ظل ظروف الديساتر في قوة الأيونية العالية والمنخفضة. يمكن تنقية إعداد الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق إجراء تبادل اللوني. كما رأينا هنا ، يتم الاحتفاظ بـ E.Coli RNA بكفاءة في قوة أيونية منخفضة ، ثم يتم الحصول عليها في قوة أيونية عالية ، مع معظم الحمض النووي الريبي الذي يتم جمعه في الكسور الثانية والثلاثة.
يمكن تنقية الحمض النووي الريبي المؤتلف إلى التجانس بواسطة 2-D electrophoresis. يسمح هذا البروتوكول بإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكية القولونية وتنقيتها إلى التجانس بفضل دائرية المنتج النهائي. تذكر أن الحمض النووي الريبي من نتائج الفائدة جزءا لا يتجزأ من سقالة الجيش الملكي النيبالي دائرية مستمدة من viroid النبات.
إذا كنت ترغب في فصل كلا moieties، تحتاج إلى استخدام استراتيجية قياسية، مثل ريبوزيميس، DNAzymes، أو العائد H.The RNase من هذا البروتوكول يعتمد على الحمض النووي الريبي خاصة من الفائدة، كما RNAs الصغيرة من المرجح أن تنتج بكميات أكبر من تلك أكبر. للتعبيرات على نطاق أوسع، تأخذ في الاعتبار أن الوقت الأمثل لحصاد البكتيريا يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك سلالة الإشريكية القولونية، متوسط الثقافة، وظروف النمو. نوصي بإجراء فحص الدورة التدريبية في الوقت الأولي للعثور على نافذة الإنتاج الأمثل في ظروفك الخاصة.
تذكر أن الرنا المؤتلف تتراكم في الخلايا البكتيرية بشكل عابر ، وأنها تختفي تمامًا في مرحلة النمو المتأخر.
