مرحبا بكم في معهد البيولوجيا الخلوية وعلم الأمراض، نيكولاي سيميونيسكو من بوخارست، رومانيا. هنا في مختبر النقل الفيروسي، نعرض جزءا من إنتاج الجسيمات الغدية باستخدام منهجية محسنة تستند إلى نظام AdEasy الذي طوره البروفيسور فوغلشتاين. الخطوات الرئيسية للتكنولوجيا لإنتاج هذه الفيروسات الغدية هي، واحد، إعادة دمج pAdTrack التي تحتوي على GFP مع pAdEasy-1 البلازميد في البكتيريا BJ5183.
اثنين، التعبئة والتغليف الجسيمات أدينوفيرالية. ثالثا، تضخيم الفيروس الغدي في خلايا AD293. أربعة، تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.
خمسة، المعايرة الفيروسية والاختبار الوظيفي للفيروس الغدي. وهنا، سنقدم خطوة هامة في المنهجية. تنقية الجسيمات الأدينوفيرالية من lysate الخلية والثقافة المتوسطة.
يبدأ تنقية الفيروس الغدي بحصاد الخلايا المنتجة للفيروس والمتوسط. تم تحويل خلايا AD293 مع البلازميد المؤتلف وكما تم حزم الفيروس الغدي. ثم تم تضخيم الفيروس الغدي من قبل الثقافات الكبيرة المتعاقبة.
هنا، حصلنا على 25 لوحة T175، وبدأنا تنقية الفيروس الغدي من lysate الخلية ووسط الثقافة. أولا، تحققنا من الفلورسينس الأخضر ل GFP الذي تعبر عنه الخلايا المنقولة. إذا كانت الخلايا لا تزال متصلة، وسوف فصل لهم عن طريق النقر على طبق الثقافة أو باستخدام مكشطة طويلة.
يتم جمع الخلايا والمتوسطة. يتم غسل قوارير مع برنامج تلفزيوني، والتي يتم جمعها أيضا في أنابيب فالكون. يتم كريات الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
الحفاظ على بيليه الخلية وكذلك وسيلة لمزيد من تنقية الفيروس الغدي. وفي هذه الخطوة، تحظى مساعدة زميل بتقدير كبير لتسريع عملية الحصاد. بيليه الخلية خضراء بسبب التعبير GFP.
يتم إعادة إنفاق بيليه في العازلة تريس hypertonic، والتي من شأنها تسهيل تعطيل الخلايا. بالنسبة لتحلل الخلايا، نستخدم النيتروجين السائل والغاز الجاف الذي يصل درجة حرارته إلى 37 درجة. لا تؤدي أكثر من ثلاث دورات لأن الفيروس سوف يتلف.
لزيادة كفاءة تعطيل الخلية تمر بعناية الخلية تجانس من خلال إبرة حقنة قياس 23. الطرد المركزي الخلية lysate في 9، 600 × ز لمدة 12 دقيقة. تمرير supernatant في أنابيب جديدة والتخلص من الكريات.
الحفاظ على supernatant على الجليد لمزيد من المعالجة عن طريق أجهزة الطرد المركزي للغاية. الآن، نعالج وسيط الثقافة لعزل الفيروس الغدي المنبعث من الخلايا. لهذا، أولا، نحن الوزن الكمية اللازمة من كبريتات الأمونيوم وإضافته إلى الزجاجة التي تم جمعها في المتوسط الثقافة.
الزجاجة تهتز بقوة حتى يتم إذابة البلورات تماما. يتم احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ونصف. ثم ينقسم تعليق الراسب إلى أنابيب فالكون.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة عند 1, 600 x g. بعد الطرد المركزي ، يتم التخلص من الناموستة العملاقة ويتم إعادة إنفاق بيليه في 10 ملليمولار تريس العازلة. إذا كان لا يمكن للمرء أن يستمر في تنقية الفيروس الغدي مع خطوة الطرد المركزي الفائق ، يمكن الاحتفاظ المرسب لبضعة أيام في أربع درجات ، ولكن فقط بعد غسيل الكلى لإزالة كبريتات الأمونيوم.
هنا، قدمنا خطوة غسيل الكلى. نحن نستخدم حقنة لإدخال التعليق في كاسيت مبلل سابقا. يتم الاتصال بالعينات مقابل 10 ملليمولار تريس العازلة بين عشية وضحاها في أربع درجات.
وتمثل الخطوة الأخيرة من تنقية خطوة الطرد الفائق على التدرج كلوريد السيزيوم متقطعة. لتشكيل التدرج، أولا، نحن ماصة ثلاثة ملليلتر من محلول الكثافة العالية من كلوريد السيزيوم. فوق هذه الطبقة، صب بلطف ثلاثة ملليلتر من كلوريد السيزيوم منخفض الكثافة.
تعليق الجسيمات أدينوفيرالي من lysate الخلية أو الوسط الثقافة ثم يتم تراكب على رأس التدرج. تمتلئ الأنابيب بالزيت المعدني ويتم إدخالها في دلاء SW41. بعد التوازن ، يتم تحميل الأنابيب بشكل متناظر في الدوار ، والذي يتم إدخاله في جهاز الطرد المركزي الفائق.
يعمل جهاز الطرد المركزي على 35,000 دورة في الدقيقة وأربع درجات لمدة 18 ساعة دون انقطاع. بعد الطرد الفائق ، يتم وضع الأنابيب على حامل مع ورقة سوداء خلفها من أجل حصاد العصابات. يتم التخلص من المرحلة العليا واضحة وحطام الخلية في حاوية النفايات مع محلول التبييض.
يتم حصاد أدنى نطاق يحتوي على الفيروس الغدي الكامل مع طرف ماصة ويتم جمعها في أنبوب Eppendorf معقم. بعد غسيل الكلى، يضاف السكروز إلى التعليق الفيروسي إلى تركيز نهائي بنسبة 4٪، ويتم الاحتفاظ بالعليكوت الفيروسي مجمدا عند ناقص 80 درجة. في قسم النتائج، أظهرنا تعبير GFP في الخلايا التي تم نقلها مع الفيروس الغدي الحصول على.
بعد 48 ساعة من التحويل ، يتم التعبير عن GFP بواسطة الخلايا المنقولة كما هو موضح في المجهر الفلوري. يتم تحديد النسبة المئوية للخلايا التعبير عن GFP عن طريق قياس التدفق الخلوي. حوالي 50٪ من الخلايا البطانية البشرية والأبقار المنقولة مع 25 وحدة نقل لكل خلية إيجابية GFP.
تم الحصول على نفس العائد من الترواية لخلايا الكبد المورين عندما تم استخدام خمس وحدات تحويل فقط لكل خلية ، ولكن هذا يرتبط بارتفاع معدل الوفيات بسبب حساسية الخلية. تم الحصول على تخفيض إلى التعبير GFP عن طريق نقل الخلايا النجمية mesenchymal بسبب التعبير المنخفض عن مستقبلات محددة. ملاحظات ختامية.
نحن تحسين هذه التكنولوجيا الشاقة للحد من الوقت والتكاليف والجهد اللازم للحصول على الجسيمات أدينوفيرالية. الفيروس الغدي المعد قادر على إصابة أنواع مختلفة من الخلايا وحفز التعبير عن جين الاهتمام.
