この方法は、研究や産業での応用に関心のある組換えRNAを大量に生成するのに役立ちます。主な利点は、組み換えRNAが簡単にスケールアップすることができる安価なプロセスで大腸菌で生成されることです。重要なことに、RNAは円形のRNA足場で生産され、均質性への精製を容易にします。
DNAやタンパク質とは対照的に、目的のRNAは、このような大腸菌培養物などのバイオファクトリー系において大量に産生されにくい。我々の方法は、非常に安定した円形足場に挿入された目的のRNAの共発現とRNAの循環を媒介するリガーゼを適用することに基づいている。円形RNA足場は特許を取られたビロイドから派生する。
ビロイドは比較的小さく、非コイリング、高塩基対円形RNAであり、いくつかの高い植物に感染する。我々は、通常の実験室の条件で細菌培養のリットル当たり組換えRNAの数十ミリグラムを生成することができます。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、PCRによってcDNAを増幅します。
次に、プラスミドpLELVd-BZBの100ナノグラムを0.5ミリリットルのチューブに加えます。タイプIIS制限酵素BpiIの10Uと十分な緩衝液Gを加え、20マイクロリットル反応を起用する。プラスミドを消化するために摂氏37度で1時間インキュベートします。
この後、TAEバッファー内の1%アガロースゲルでの電気泳動によりPCRと消化産物を分離します。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの濃度で200ミリリットルの臭化エチジウムで振ってゲルを汚す。UVトランスイルミニューエータを使用して、DNAを可視化します。
メスを使用して、増幅されたcDNAとBpiI消化プラスミドに対応するバンドを切り取ります。シリカゲルカラムを使用して、ゲルフラグメントからDNAを溶出する。分光光度分析によりDNAの濃度を定量化します。
増幅されたcDNAと消化されたプラスミドを使用してギブソンアセンブリの反応を設定します。摂氏50度で1時間インキュベートします。次いで、シリカゲルカラムを用いて反応を精製する。
有能な大腸菌DH5-アルファ細胞を電気ポレートした後、いくつかの白いコロニーを選び、液体LB培地に移します。摂氏37度で一晩コロニーを成長させます。次に、miniprepキットを使用してプラスミドを精製し、TAEバッファー内の1%アガロースゲルで電気泳動によってそのサイズを分析します。
まず、選択した大腸菌株を、目的のRNAに対応するcDNAとプラスミドP15LTRNISMを含むpLELVd-BZB誘導体の両方と共に電気ポポレートし、ナスtRNAリガーゼを共発現させる。SOC液培地をエレクトロポレーションキュベットに移して細胞を回収し、摂氏37度で1時間インキュベートする。次に、1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラム、1ミリリットルクロラムフェニコールあたり34マイクログラムを含むLB固体培地に細菌をプレートします。
一晩摂氏37度でインキュベートします。翌日、1リットルのバッフルアーレンマイヤーフラスコに、1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラム、ミリリットルクロラムフェニコールあたり34マイクログラムを含む液体結核培地を250ミリリットル加える。インキュベートされた大腸菌を取り出し、コロニーを摘み取り、フラスコ中の培地を接種する。
180 RPMで12~16時間激しく揺れ、37°Cでインキュベートしてから、細菌を収穫します。収穫した大腸菌培養物を250ミリリットルの遠心分離機ボトルに注ぎ、14,000 Gで10分間細胞を回転させます。上清を捨て、30ミリリットルの水で細胞を再懸濁します。
この懸濁液を遠心管に移し、前の条件を使用して再び細胞を回転させます。上清を捨て、細胞ペレットにクロマトグラフィーバッファーを10ミリリットル加えます。渦は、バッファー内の細胞を再中断する。
フェノールの1つのボリュームを追加:クロロホルムと渦を激しく細胞を壊すために。その後、12,000Gで遠心分離機を10分間行う。水相を回収し、クロロホルムの1つのボリュームを加え、渦を激しく加えます。
遠心分離機は12,000Gで10分間行う。この後、45マイクロメートルのシリンジフィルターを介してRNA調製物をフィルター処理します。液体クロマトグラフィーシステムに接続された1ミリリットルのジエチルエタノールアミンカラムを使用してRNAを精製します。
1分間に1ミリリットルの流量を調整し、10ミリリットルのクロマトグラフィーバッファーでカラムを平衡化します。その後、サンプルをロードし、10ミリリットルのクロマトグラフィーバッファーでカラムを洗浄します。溶出バッファーの 20 ミリリットルで RNA をエルプし、1 ミリリットルのアリコートを収集します。
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、円形RNAを直線的なRNAと分離します。まず、TBEバッファーに5%のポリアクリルアミドゲルを調製し、テキストプロトコルで概説されているように8つの臼歯尿素を含む。20マイクロリットルのRNA調製物を1体積のローディングバッファと混合します。
暖房ブロックで摂氏95度で1.5分間インキュベートし、氷の上でスナップクールします。ポリアクリルアミドゲルにサンプルをロードし、ゲル次元に適した条件で電気泳動を実行します。この後、ゲルを1ミリリットルの臭化エチジウム10マイクログラムで15分間染色する。
染色したゲルを水で洗い、UV光の下でRNAを可視化します。異なるcDNAが挿入されたいくつかの組換えプラスミドの電気泳動分析は、pLELVd-BZBと比較して異なるマイグレーションを示す。pLELVd-BZBにはlacZマーカーが含まれており、これは目的のRNAに対応するcDNAに置き換えられるため、移行は挿入されたcDNAのサイズに依存しますが、組換えプラスミドは通常、コントロールプラスミドよりも速く移行します。
共エレクトロポレートされた細菌培養における組換えRNAの産生は、細胞を破壊し、変性PAGEによってRNAを分析することによって監視される。強いバンドは、目的の異なるRNAが挿入された空のELVdおよびキメラELVd形態に対応して見ることができます。興味深いことに、組換えRNAの主要な部分は円形の形態として見られる。
主分画の円形度は、高いイオン強度と低イオン強度で変性条件下で2つのPAGEを組み合わせて使用することによって観察される。RNA製剤は、アニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。ここで見られるように、大腸菌RNAは、低イオン強度で効率的に保持され、その後高いイオン強度で溶出し、RNAのほとんどが画分2と3で収集されています。
組換えRNAは、さらに2次元電気泳動により均質に精製することができる。このプロトコルは、エシェリヒア・コリでの大量の組換えRNAの生産を容易にし、最終製品の循環性のおかげで均質性への精製を可能にする。目的のRNA結果は、植物のビロイドに由来する円形のRNA足場に埋め込まれていることを覚えておいてください。
両方の部分を分離したい場合は、リボザイム、DNAzymes、RNase H.このプロトコルの収量は、小さなRNAがより大きなRNAよりも高い量で生成される可能性が高いため、関心のある特定のRNAに依存する標準的な戦略を使用する必要があります。より大きなスケールの表現では、細菌を収穫するのに最適な時間は、大腸菌株、培養培地、成長条件を含む多くの要因に依存することを考慮に入れてください。お客様の特定の条件で最適な生産期間を見つけるために、予備的な時間コースアッセイをお勧めします。
組換えRNAは細菌細胞に一過性に蓄積し、それらは後期成長期に完全に消失することを覚えておいてください。
