هذه الطريقة تمكن من التحقيق في آثار أنظمة التحميل الميكانيكية المختلفة، والظروف البيئية، أو مراحل انحطاط الغضاريف على ضعف chondrocytes المفصلي في الموقع. القوى المادية. على عكس التقنيات الأخرى، يتم تنفيذ هذه القياسات في الوقت الحقيقي وفي غضروف سليمة تماما دون المساس ظروف الحدود الأصلية.
ميزة أخرى لهذه التقنية هو أنه يستخدم نموذج الماوس، مما يسمح باختبار كيفية تأثير الجينات محددة على قابلية chondrocytes في الموقع في الإصابة الميكانيكية. لتشريح عظم الفخذ القاصي، ضع الماوس في موقف supine وجعل شق الجلد 5 ملليمتر على الجزء الأمامي من الركبة. تمديد شق على طول الطريق حول الركبة.
وسحب الجلد لفضح مفصل الركبة وعضلات الساق. بدءا من نهاية قريبة من عظم الفخذ، واستخدام عدد واحد عشر شفرة مشرط لقطع على طول العظام في الاتجاه القعد. وضع الشفرة بين وحدة وتر العضلات الرباعية والجانب الأمامي من رمح الفخذ.
تمديد شق الماضي الرضفة. قطع من خلال منتصف وتر الرضفة لإزالة وحدة وتر العضلات رباعية. بعد ذلك ، بدءًا من الطرف القريب لعظم الفخذ ، ضع شفرة المشرط بين وحدة وتر عضلة أوتار الركبة والجانب الخلفي من رمح الفخذ وقطع على طول العظم في الاتجاه القاصي.
عندما يقترب شق مفصل الركبة، وقطع من خلال الأنسجة الرخوة، والانتهاء من قطع الماضي مفصل الركبة. سحب رباعيات وعضلات أوتار الركبة لفضح عظم الفخذ. وقطع أي العضلات الزائدة على الجانبين الجانبي و الوسط من العظام.
قطع عضلة ربلة الساق على الجانب الخلفي من الساق القريبة. و اقلب الساق لتصور الجانب الخلفي لعظم الفخذ إزالة الأنسجة الزائدة حول مفصل الركبة لفضح condyles القعر من عظم الفخذ والسطح الخلفي من الساق القريبة.
قطع الأربطة الصليبية الأمامية والخلفية بعيدا عن condyles الفخذ. و إسحب الساق بعيدا عن عظم الفخذ، وقطع كل الأربطة لفصل الجزء السفلي من الساق من عظم الفخذ. باستخدام مقص التشريح القياسية، وقطع من خلال عظم الفخذ في نهاية قريبة من العظام حوالي ثمانية ملليمترات فوق المفصل tibiofemoral من الجانب الجانبي.
واستخدم ملقط الصائغ لإزالة الأنسجة الرخوة المحيطة من عظم الفخذ. ثم فضح الغضروف على كل من condyles في نهاية نهاية عظم الفخذ. هيدرات دوريا السطح المفصلي مع HBSS.
لتشريح من الزّم، ضع الفأر في موقف الزفير. واستخدم المقص الصغير لعمل شق من خمسة ملليمترات على الجانب الخلفي من الكوع. تمديد شق حول الكوع وسحب الجلد لفضح العضلات على الذراع والكتف.
بدءا من نهاية قريبة من عظم العضد، ووضع شفرة من مشرط أحد عشر رقم بين وحدة وتر العضلات ثلاثية الرؤوس والجانب الخلفي من عظم العضد. وقطع على طول العظام في اتجاه القاصي. تمديد شق نحو نهاية سحّة من العضد، من خلال وتر ثلاثية الرؤوس وسحب ثلاثيات الرؤوس مرة أخرى نحو نهاية قريبة من العضد حتى يتعرض الرأس العضد.
قطع النسيج الضام حول رأس الضمة دون لمس السطح المفصلي. و أخرجي الطرف من الجسم هيدرات السطح المفصلي لرأس humeral مع HBSS.
لفصل العضد من الذراع، واستخدام ملقط لكسر نهاية قريبة من الزنا على الجانب الخلفي من الذراع. وقطع النسيج الضام حول نهاية القضم من عظم العضد، وإزالة أي الأنسجة الزائدة على العظام. ثم استخدام مقص تشريح القياسية لإزالة الدليتود tuberosity على الجانب الخلفي من الزمر.
ووضع العينة تشريح في أنبوب 1.5 ملليلتر microcentuge التي تحتوي على HBSS. بالنسبة لـ Calcein AM تلطيخ العينات، قم بنقل العظام إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر يحتوي على 500 ميكرولترات من 10.05 ميكرو مولر كالسين في HBSS. ووضع الأنبوب في خلاط حراري عند 37 درجة مئوية عند 800 دورة في الدقيقة، محمي من الضوء.
بعد ثلاثين دقيقة، وغسل العينة في HBSS الطازجة لمدة عشر دقائق. ونقل العينة على الشريحة الزجاجية من المجهر العرف شنت جهاز الاختبار الميكانيكية، بحيث السطح المفصلي من condyles الفخذ الخلفي أو رأس humeral يجلس على الزجاج. هيدرات العينة مع HBSS ووضع الجهاز مع العينة على مرحلة المجهر الفلوري.
صورة chondrocytes المفصلي ملطخة مع Calcein AM قبل تطبيق التحميل تحت التكبير 4x. اضبط إعدادات الامتلاك لتحسين جودة الصورة. لتطبيق تحميل ميكانيكي ثابت، عقد تحميل ثابت المنصوص عليها على رأس العينة بحيث يتم ضغط الغضروف المفصلي ضد الزجاج غطاء لمدة خمس دقائق قبل إزالة الحمل.
لتطبيق حمولة ميكانيكية تأثير، إسقاط تأثير أسطواني من الوزن المعروف على العينة من ارتفاع المقررة، والإفراج عن الحمل خمس ثوان بعد الاصطدام. مباشرة بعد إزالة أي من الحمل، احتضان العينة في إعداد حديثا 60 ميكرو مول بروريديوم يوديد في ملليلتر واحد من HBSS. لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إعادة صورة chondrocytes المفصلي عن طريق المجهر الفلورسي كما أظهرت للتو.
لتحديد مساحة الخلايا المصابة والميتة بسبب نظام التحميل الميكانيكية التطبيقية ، قم أولاً بفتح الميكروفات الدقيقة للسطح المفصلي المكتسبة قبل وبعد تطبيق الحمل الميكانيكي في ImageJ. دمج الصور في كومة. تعيين مقياس الصور استناداً إلى دقة الصورة.
بعد ذلك، حدد المنطقة التي أصبحت فيها الخلايا سالبة وPI موجبة. وتعتبر هذه الخلايا مصابة أو ميتة. ثم تحديد مساحة الخلايا الميتة المصابة باستخدام أداة القياس.
على الأقل ستة اختبار تطبيق بروتوكولات التحميل reproduced بشكل مُسْتَرَحِد كمّياً مناطق موضعية قابلة للقياس الكمي من إصابات الخلية في الفخذ والغضاريف العضدية التي تم الحصول عليها من ثمانية إلى عشرة أسابيع من الفئران صمام C. في جميع بروتوكولات التحميل التي تم اختبارها ، أدت مقادير الحمولة الأعلى وشدة الارتطام الأعلى إلى تفاقم المدى الأقصى لإصابة الخلايا في كل من عظم الفخذ والهميري. أثناء إجراء التشريح من المهم أن نتذكر عدم الاتصال بالغضروف المفصلي مع الأدوات الجراحية ، لأن هذا قد يعرض خط الأساس للخطر من خلال قدرة العينات.
استخدام هذا النموذج المتطابق قد يسهل البحث في هشاشة العظام، كما يتم بسهولة الناجمة عن المرض في الفئران من خلال التلاعب الجينية، أو الغذائية، أو الجراحية. كما توفر منصتنا أداة لاستجواب أسئلة العلوم الأساسية وفحص التدخلات العلاجية التي تستهدف الضعف الميكانيكي للشوكندريات.
