이 방법을 사용하면 다양한 기계적 적재 요법, 환경 조건 또는 연골 변성의 단계가 시상 동맥 연골세포의 취약성에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 물리적 인 힘. 다른 기술과 달리 이러한 측정은 네이티브 경계 조건을 손상시키지 않으면서 실시간으로 완전히 손상되지 않은 연골에서 수행됩니다.
이 기술의 또 다른 장점은 마우스 모델을 사용하여 특정 유전자가 기계적 상해에서 시투 연골 세포의 감수성에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 것입니다. 해사 대퇴골의 해부의 경우 마우스를 척추 위치에 놓고 무릎의 전방 부분에 5 밀리미터 피부 절개를 합니다. 절개를 무릎 주위로 확장합니다.
그리고 무릎 관절과 다리 근육을 노출피부를 다시 당깁니다. 대퇴골의 근위 쪽 끝에서 시작하여, 11번 메스 블레이드를 사용하여 말단 방향으로 뼈를 따라 자른다. 사두근 근육 힘줄 단위와 대퇴 샤프트의 전방 측 사이에 블레이드를 배치합니다.
슬개골을 지나 절개를 확장합니다. 사두근 근육 힘줄 단위를 제거하기 위해 슬개골 힘줄의 중간을 절단. 다음으로, 대퇴골의 근위쪽 끝에서 시작하여, 햄스트링 근육 힘줄 단위와 대퇴샤프트의 후방 측 사이에 메스 블레이드를 배치하고 말단 방향으로 뼈를 따라 자른다.
절개가 무릎 관절에 접근하면 연조직을 잘라 무릎 관절을 지나 컷을 완료합니다. 사두근과 햄스트링 근육을 뒤로 당겨 대퇴골을 노출시하십시오. 그리고 뼈의 측면과 내측에 어떤 과잉 근육을 잘라.
근위 경골의 후방 측에 있는 종아리 근육을 잘라냅니다. 그리고 대퇴골의 후방 측면을 시각화하기 위해 다리를 뒤집습니다. 대퇴골의 단열 결체와 근위 경골의 후방 표면을 노출하기 위해 무릎 관절 주위의 과잉 조직을 제거합니다.
대퇴엽에서 전방 및 후방 십자 인대를 잘라. 그리고 대퇴골에서 경골을 당겨 대퇴골에서 하반신을 분리하기 위해 모든 인대를 절단합니다. 표준 해부 가위를 사용하여, 측면에서 경골 관절 위의 약 8 밀리미터 뼈의 근위 끝에 대퇴골을 잘라.
그리고 주얼러의 집게를 사용하여 대퇴골에서 주변 의 연조직을 제거하십시오. 그런 다음 대퇴골의 말단 끝에 두 연골에 연골을 노출시합니다. HBSS로 관절 표면을 주기적으로 수화합니다.
상완골의 해부의 경우 마우스를 척추 위치에 놓습니다. 그리고 마이크로 가위를 사용하여 팔꿈치의 후방 쪽에 5 밀리미터 절개를합니다. 팔꿈치 주위의 절개를 확장하고 팔을 넓히기 위해 피부를 뒤로 당깁니다.
상완골의 근위 쪽 끝에서 시작하여 삼두근 근육 힘줄 단위와 상완골의 후방 측 사이에 숫자 11 메스의 블레이드를 배치합니다. 그리고 말단 방향으로 뼈를 따라 잘라. 상완골의 단부 끝으로 절개를 확장하고 삼두근 힘줄을 통해 상완골 머리가 노출 될 때까지 상완골의 근위 끝을 향해 삼두근을 다시 당깁니다.
관절 표면에 닿지 않고 상완골 머리 주위의 결합 조직을 잘라냅니다. 그리고 몸에서 사지를 제거합니다. 후얼 머리의 관절 표면을 HBSS로 수분처리합니다.
팔의 상완골을 분리하려면 집게를 사용하여 팔의 후방 쪽의 척골끝의 근위 쪽 끝을 분리합니다. 그리고 상완골의 말단 주위 의 결합 조직을 잘라, 뼈에 어떤 과잉 조직을 제거. 그런 다음 표준 해부 가위를 사용하여 상완골의 후방 측에 있는 망상 형 관성을 제거합니다.
그리고 해부된 표본을 HBSS를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 놓습니다. 샘플의 Calcein AM 염색의 경우, HBSS에서 10.05 마이크로 리터의 500 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 뼈를 전송합니다. 그리고 온도800 rpm에서 온도 37도의 온도에서 튜브를 온도로부터 보호합니다.
30분 후, 신선한 HBSS로 시편을 10분간 세척합니다. 그리고 후피대모덕추도또는 상완두환의 관절표면이 유리에 앉아 있는 등, 맞춤형 현미경 장착 기계시험 장치의 유리 슬라이드에 표본을 이송한다. HBSS로 시편을 수분화하고 시편을 형광 현미경 단계에 배치합니다.
4배 배율 하에서 하중 적용 전에 Calcein AM으로 염색된 관절 연골 세포를 이미지합니다. 수집 설정을 조정하여 이미지 품질을 최적화합니다. 정적 기계적 하중을 적용하려면, 하중을 제거하기 전에 5 분 동안 관절 연골이 커버 유리에 대해 압축되는 것을 시편 위에 규정 된 정적 부하를 유지합니다.
충격 기계적 부하를 적용하려면 알려진 중량의 원통형 충격기를 지정된 높이에서 시편에 떨어뜨려 충격 5초 후에 하중을 방출합니다. 어느 부하가 제거된 직후, 새로 준비된 60 마이크로 어어 프로프리듐 요오드에 표본을 HBSS 1밀리리터로 배양한다. 실온에서 5분 동안, 단지 입증된 것처럼 형광 현미경으로 관절 연골을 다시 이미지화합니다.
적용된 기계적 적재 요법으로 인해 부상 및 죽은 세포의 면적을 정량화하기 위해, 먼저 ImageJ에서 기계적 하중을 적용하기 전과 후에 획득한 관절 표면의 현미경 그래프를 엽니다. 이미지를 스택에 결합합니다. 이미지 해상도를 기반으로 이미지의 배율을 설정합니다.
다음으로, 세포가 칼신 음성 및 PI 양성이 된 영역을 정의합니다. 이 세포는 다친 또는 죽은 것으로 간주됩니다. 그런 다음 측정 도구를 사용하여 부상당한 죽은 세포의 영역을 결정합니다.
적어도 6개의 시험된 로딩 프로토콜은 8주에서 10주 된 밸브 C 마우스에서 얻은 대퇴및 상완연골에서 세포 손상의 정량화 된 지역적 영역을 재현가능하게 유도하였다. 테스트된 모든 로딩 프로토콜에서, 높은 부하 크기와 높은 충격 강도는 대퇴골과 후너리 모두에서 세포 손상의 간격 범위를 크게 악화시켰습니다. 해부를 수행하는 동안 수술 도구와 관절 연골에 접촉하지 않는 것이 중요합니다, 이것은 표본의 능력에 의해 기준선을 손상시킬 수 있기 때문에.
이 미러링 모델의 사용은 질병이 유전, 식이, 또는 외과 적 조작을 통해 마우스에서 쉽게 유도하기 때문에 골관절염에서의 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 우리의 플랫폼은 또한 기본 과학 질문을 심문하고 연골세포의 기계적 취약성을 대상으로 치료 개입을 선별하기위한 도구를 제공합니다.
