يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الجينوم من خلال إظهار كيفية تصميم وتنفيذ أداة قائمة على التسلسل لتقييم تأثير العوامل البيئية على ميثيل الحمض النووي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها يمكن أن توفر طريقة أكثر شمولا وكمية لتقييم مستويات ميثيل الحمض النووي مقارنة بالمنصات القائمة على المصفوفة. وتمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحديد تغيرات تشوهات الحمض النووي بسبب أنواع مختلفة من العمليات الفسيولوجية في أي كائن يكون بيانات تسلسله متاحة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتأثير الإجهاد على ميثيل الحمض النووي، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على العوامل البيئية الأخرى أو الظروف الفسيولوجية، مثل التعرض للمواد السامة البيئية في النظام الغذائي عالي الدهون وحالات مثل مرض السكري وأمراض القلب والأوعية الدموية. بعد القص الحمض النووي والتحقق من الحجم عبر bioanalyzer، إضافة 180 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي الحمض النووي الملزمة لكل عينة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بيليه الخرز على لوحة مغناطيسية، وإزالة supernatant.
Resuspend بيليه في 200 microliters من 70٪ الإيثانول. المقبل، واستخدام لوحة مغناطيسية ل بيليه الخرز، وإزالة أكبر قدر من الإيثانول ممكن. جفف الخرز في كتلة حرارة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق.
ثم، إعادة بناء بيليه في 44 ميكرولترات من المياه الخالية من النوى، وجمع ما يقرب من 42 ميكرولترات من نابيرانت. بعد ربط المحولات والتحقق من الربط عبر bioanalyzer ، نقل العينات إلى أنابيب صغيرة مركزية ملزمة للحمض النووي منخفضة. ثم، استخدام مكثف فراغ ساخنة للحد من حجم العينة أقل من 3.4 ميكرولترات.
بعد ذلك، إضافة 5.6 ميكرولترات من الميثيل-Seq كتلة ميكس إلى كل عينة، واحتضان لهم في دورة حرارية. تحضير الدمج مكتبة التهجين الدمج وفقاً بروتوكول النص. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من الدمج مكتبة التهجين مزيج لكل عينة، واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
قرب نهاية فترة الحضانة، وإعداد streptavidin الخرز المغناطيسي بإضافة 50 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي streptavidin لكل عينة إلى أنبوب قطاع 8-جيدا جديدة. غسل الخرز مع 200 ميكرولترات من الميثيل-SEQ ملزم العازلة. وضع أنبوب الشريط على لوحة مغناطيسية، وإزالة افرنح من الخرز.
ثم، resuspend الخرز في 200 ميكرولترات من الميثيل-SEQ ملزمة العازلة. إضافة العينات إلى الخرز streptavidin غسلها، واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على خلاط الدورية. في حين أن العينات مزيج، aliquot 200 ميكرولترات من الميثيل-SEQ غسل العازلة اثنين في آبار ثلاثية من لوحة 96 جيدا وpre-warm إلى 65 درجة مئوية.
بعد العينات احتضان، بيليه الخرز المغناطيسي مع لوحة مغناطيسية وإزالة supernatant. ثم، resuspend الخرز في 200 ميكرولترات من الميثيل-SEQ غسل العازلة واحد. احتضان الخرز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، واستخدام لوحة مغناطيسية لإزالة supernatant.
بعد هذا، resuspend بيليه حبة في 200 microliters من قبل الدافئ غسل العازلة اثنين. ثم، احتضان الخرز في دورة حرارية قبل استخدام لوحة مغناطيسية ل بيليه الخرز. إضافة 20 ميكرولترات من الميثيل-Seq Elution العازلة إلى الخرز غسلها، واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
استخدام لوحة مغناطيسية ل بيليه الخرز، ونقل افرحة إلى أنبوب شريط جديد. أولاً، إضافة 130 ميكرولترات من كاشف تحويل ثنائي الفلتر إلى المكبر الذي تم جمعه من قبل. تقسيم ردود الفعل 150 ميكرولتر بالتساوي إلى بئرين.
ثم، احتضان ردود الفعل في دورة حرارية. استخدام 600 ميكرولتررس من التوثيق العازلة لربط العينات إلى الأعمدة تدور، وغسل الأعمدة مع 100 ميكروليتر من الغسيل العازلة. ثم، الطرد المركزي الأعمدة، وتجاهل تدفق من خلال.
بعد هذا، إضافة 200 ميكرولترات من العازلة Desulphonation إلى الأعمدة. احتضان الأعمدة لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأعمدة مرتين بـ 200 ميكرولترات من الغسيل المؤقت.
ثم، إضافة 10 ميكرولترات من عازلة Elution إلى العمود. احتضان في درجة حرارة الغرفة، والطرد المركزي. إعداد تفاعل تفاعل PCR الرئيسية مزيج وفقا لبروتوكول النص.
ثم، إضافة 82 ميكرولترات من المزيج الرئيسي لكل عينة، واحتضان العينات في دورة حرارية. أولا، إعداد PCR ماجستير ميكس اثنين على الجليد وفقا لبروتوكول النص. ثم، إلى كل عينة، إضافة 25.5 ميكرولترات من PCR ماجستير ميكس اثنين وخمسة microliters من التمهيديات الفهرسة التجارية، واحتضان العينات في دورة حرارية.
تقييم تركيز الحمض النووي للعينات مع الكواشف عالية الحساسية للكشف عن الحمض النووي على محلل حيوي. ثم تُقدَّم مكتبات ميثيل - سِك للتسلسل على مُسَرِّس الجيل التالي. بعد تحويل البيسولفيت وPCR تضخيم عينات التحقق من الصحة، وإعداد مزيج رئيسي مع العازلة ملزمة، والمياه، والخرز sepharose المغلفة streptavidin.
ثم، إضافة 75 ميكرولترات من المزيج الرئيسي وخمسة ميكرولترات من المنتج PCR متداخلة إلى لوحة 96 جيدا، ويهز لوحة على لوحة شاكر لمدة 15 إلى 60 دقيقة. في حين أن لوحة يهز، إضافة 12 ميكرولترات من التمهيدي إلى آبار لوحة فحص ايروسير. بعد الاهتزاز، ضع أداة فراغ في حوض مليء بالماء، ثم ضع الأداة في اللوحة مع ردود فعل ملزمة.
بعد ذلك، غمر أداة الفراغ في أحواض نصف مملوءة تحتوي على 70٪ من الإيثانول، هيدروكسيد الصوديوم، ومخزن تريس-أسيت. قطع الفراغ، ووضع أداة فراغ في لوحة فحص HS pyrosequencing لنقل الخرز. ضع الطبق على كتلة حرارة، ويحضن عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
وأخيرا، السماح لوحة لتبرد لمدة خمس دقائق قبل بدء برنامج بيرو. وفي هذا البروتوكول، وفر تحليل مكتبات الميثيل - سeq قائمة مرتبة من المناطق الميثيلية بشكل تفاضلي، أو DMRs، بين الحيوانات المجهدة وغير المجهدة ومؤامرة رسومية من نظم رصد الحساسية الرقمية(100) وأظهرت التحقق من صحة هذه المستويات عن طريق البايروسبيت بيريوزكينكينينغ أن الحيوانات المُجهدة جميعها أظهرت مستويات مُيثيل أعلى في جميع أنواع الحديد المُزَنَّع من الحيوانات غير المجهدة.
كما قورنت مستويات المثيل في Cpg 10 بمستويات الكورت المتوسطة لمدة ثلاثة أسابيع لكل. وتشير النتائج إلى وجود علاقة متواضعة بين بيانات الغدد الصماء والبيانات الميثيل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أن نقارن الزيادة في متوسط حجم الحمض النووي بين خطوات القص الحمض النووي وخطوات ربط المحولات وضمان كمية مكتبة كافية قبل التسلسل.
وفي أعقاب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ نُهج أخرى مماثلة للإجابة على أسئلة جديدة، مثل تأثير المواد السامة البيئية على تنمية الجرذان العصبية. بعد تطورها، وفرت هذه التقنية الوسائل للباحثين في مجال علم الوراثة اللاجينية لاستكشاف التغيرات في وميض الحمض النووي على نطاق الجينوم في أي كائنات غير نموذجية أو كائنات اٍيُضِّجة حيث تتوفر تسلسلات جينومية. لا تنس أن العمل مع الإنزيمات الحساسة لدرجة الحرارة يتطلب التخزين على الجليد أثناء الاستخدام والتخزين في الفريزر ناقص 20 درجة.
تتطلب حبات الحمض النووي الريبي المستخدمة لالتقاط الهدف ذوبان الجليد وتخزينه على الجليد أثناء الاستخدام والتخزين على المدى الطويل في الفريزر ناقص 80 درجة.
