Bu yöntem, çevresel faktörlerin DNA metilasyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için sıralama ya da sıralama tabanlı bir aracın nasıl tasarlanacağını ve uygulanacağını göstererek epigenomik alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, dizi tabanlı platformlara göre DNA metilasyon düzeylerini değerlendirmek için daha kapsamlı ve nicel bir yöntem sunabilmektir. Bu tekniğin sonuçları, dizi verileri mevcut olan herhangi bir organizmada farklı fizyolojik süreçler nedeniyle DNA metilasyon değişikliklerinin tanımlanmasına yöneliktir.
Bu yöntem, stresin DNA metilasyonu üzerindeki etkisihakkında bilgi sağlasa da, yüksek yağlı beslenmede çevresel toksik maddelere maruz kalma ve diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi durumlar gibi diğer çevresel faktörlere veya fizyolojik koşullara da uygulanabilir. DNA'yı yonttup biyoanalizör aracılığıyla boyutu doğruladıktan sonra, her numuneye 180 mikrolitre DNA bağlayıcı manyetik boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatın. Bir manyetik plaka üzerinde boncuk pelet ve supernatant kaldırın.
Peletin 200 mikrolitresi %70 etanolde yeniden askıya alın. Daha sonra, boncuk pelet için bir manyetik plaka kullanın ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak. Boncukları 37 derecede bir ısı bloğunda 3-5 dakika kurutun.
Daha sonra, nükleaz içermeyen su 44 mikrolitre pelet resuspend ve supernatant yaklaşık 42 mikrolitre toplamak. Adaptörleri bağladıktan ve biyoanalizör aracılığıyla ligasyonu doğruladıktan sonra, numuneleri düşük DNA bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Daha sonra, örnek hacmini 3,4 mikrolitrenin altına düşürmek için ısıtmalı vakum konsantratörü kullanın.
Bundan sonra, her numuneye 5,6 mikrolitre Metil-Seq Blok Karışımı ekleyin ve onları bir termal döngüde kuluçkaya yatırın. Metin protokolüne göre Yakalama Kitaplığı Hibritleştirme Karışımı'nı hazırlayın. Daha sonra, her örneğe 20 mikrolitre Yakalama Kitaplığı Hibridizasyon Karışımı ekleyin ve 16 saat boyunca 65 santigrat derecede kuluçkaya yatın.
Kuluçka döneminin sonlarına doğru, yeni bir sekiz kuyu şerit tüp için örnek başına streptavidin manyetik boncuk50 mikrolitre ekleyerek streptavidin manyetik boncukhazırlamak. Boncukları 200 mikrolitre Metil-Seq Bağlayıcı Tampon ile yıkayın. Şerit tüpü manyetik bir plakaya yerleştirin ve boncuklardan süpernatantı çıkarın.
Sonra, Metil-Seq Bağlayıcı Tampon 200 mikrolitre boncuk resuspend. Yıkanmış streptavidin boncuk örnekleri ekleyin ve dönen bir mikser üzerinde 30 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Örnekler karıştırılırken, aliquot 200 mikrolitre Metil-Seq Yıkama Tampon 2 96-well plaka ve önceden sıcak 65 santigrat dereceye kadar triplicate kuyular içine.
Örnekler inkümledikten sonra manyetik boncukları manyetik plakayla peletleyin ve süpernatantı çıkarın. Sonra, Metil-Seq Yıkama Tampon Bir 200 mikrolitre boncuk resuspend. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca boncuk kuluçka ve supernatant kaldırmak için bir manyetik plaka kullanın.
Bundan sonra, önceden ısıtılmış Yıkama Tampon İki 200 mikrolitre boncuk pelet resuspend. Daha sonra, boncukpelet için bir manyetik plaka kullanmadan önce bir termal döngü içinde boncuk kuluçka. Yıkanmış boncuklara 20 mikrolitre Metil-Seq Elution Tampon ekleyin ve 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Boncukpelet için bir manyetik plaka kullanın ve yeni bir şerit tüp için supernatant aktarın. İlk olarak, daha önce toplanan supernatant bisülfit dönüşüm reaktif 130 mikrolitre ekleyin. 150 mikrolitrelik reaksiyonları eşit olarak iki kuyuya bölün.
Sonra, reaksiyonları bir termal döngüde kuluçkaya yatırın. Örnekleri spin sütunlarına bağlamak için 600 mikrolitre Ciltli Tampon kullanın ve sütunları 100 mikrolitre Yıkama Tamponu ile yıkayın. Daha sonra, sütunları santrifüj edin ve akış tan atın.
Bundan sonra, sütunlara 200 mikrolitre Desülfobi Tampon ekleyin. Oda sıcaklığında 15-20 dakika boyunca sütunkuluçka. 200 mikrolitre Yıkama Tamponu ile sütunları iki kez yıkayın.
Ardından, sütuna 10 mikrolitre Elüyon Arabelleği ekleyin. Oda sıcaklığında kuluçka ve santrifüj. METIN protokolüne göre PCR reaksiyon ana karışımını hazırlayın.
Daha sonra, her numuneye ana karışımın 82 mikrolitresini ekleyin ve numuneleri bir termal döngüde kuluçkaya yatırın. İlk olarak, metin protokolüne göre PCR Master Mix Two'yu buz üzerinde hazırlayın. Daha sonra, her numuneye 25,5 mikrolitre PCR Master Mix İki ve beş mikrolitre ticari indeksleme astarı ekleyin ve numuneleri bir termal döngüde kuluçkaya yatırın.
Bir biyoanalizörde yüksek duyarlılıklı DNA algılama reaktifleri ile numunelerin DNA konsantrasyonu değerlendirilin. Metil-Seq kütüphaneleri daha sonra yeni nesil sıralayıcı üzerinde sıralama için gönderilir. Bisülfit dönüştürme ve PCR güçlendirme doğrulama örnekleri sonra, Bağlayıcı Tampon, su ve streptavidin kaplı sepharoz boncuk ile bir ana karışımı hazırlamak.
Daha sonra, ana karışımın 75 mikrolitresini ve iç içe ki PCR ürününün beş mikrolitresini 96 kuyulu bir plakaya ekleyin ve plakayı 15 ila 60 dakika boyunca bir tabak çalkalayıcının üzerinde sallayın. Plaka sallanırken, pyrosequencing bir tofaş plaka kuyularına 12 mikrolitre astar ekleyin. Salladıktan sonra, su dolu bir çukura bir vakum aleti yerleştirin, sonra bağlayıcı reaksiyonlar ile plaka aracı yerleştirin.
Daha sonra, vakum aracını %70 etanol, sodyum hidroksit ve Tris-asetat tamponu içeren yarı dolu çukurlara batırın. Vakumun bağlantısını kesin ve boncukları aktarmak için vakum aletini HS pyrosequencing teşp plakasına yerleştirin. Plakayı bir ısı bloğuna yerleştirin ve 80 derecede iki dakika kuluçkaya yatırın.
Son olarak, piro programı başlamadan önce plaka beş dakika soğumasını bekleyin. Bu protokolde, Metil-Seq kütüphanelerinin analizi, stresli ve stresli olmayan hayvanlar ile DM'lerin grafiksel çizimi arasında farklılaştırılmış metillenmiş bölgelerin veya DM'lerin sıralı bir listesini sağlamıştır.
CpG 10'daki metilasyon düzeyleri de her hayvan için ortalama üç haftalık CORT düzeyleriile karşılaştırıldı. Sonuçlar endokrin ve metilasyon verileri arasında mütevazı bir korelasyon olduğunu göstermektedir. Bu yordamı denerken, DNA kesme ve adaptör ligasyon adımları arasında ortalama DNA boyutundaki artışı karşılaştırmayı ve sıralamadan önce yeterli kütüphane miktarını sağlamayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, diğer benzer yaklaşımlar yeni sorulara cevap vermek için uygulanabilir, sıçan nörogelişimi üzerinde çevresel toksik maddelerin etkisi gibi. Bu teknik, gelişiminden sonra epigenetik alanındaki araştırmacılara genomdizilerinin mevcut olduğu model olmayan veya model organizmalardaki genom çapındaki DNA metilasyon değişikliklerini keşfetme imkanı sağladı. Isıya duyarlı enzimlerle çalışmanın, eksi 20 derecelik dondurucuda kullanılırken ve depolanırken buzüzerinde depolanması gerektiğini unutmayın.
Hedef yakalama için kullanılan RNA boncukları, eksi 80 derecelik dondurucuda kullanılırken ve uzun süreli depolama sırasında buz üzerinde erime ve depolama gerektirir.
