The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+separation+of+purines,+pyrimidines,+and+nucleosides+by+paper+chromatography.">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory.">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes &amp; Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li><li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+roles+in+mammalian+development.">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li><li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance:+myths+and+mechanisms.">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer.">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, S4-S11 (2005).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+epigenome:+its+origins,+contributions+to+tumorigenesis,+and+translational+implications.">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li><li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis.">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li><li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis.">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li><li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In.">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li><li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS/AS+imprinted+region:+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA.">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li><li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bisulfite+sequencing+for+examination+of+DNA+methylation+with+gene+and+nucleotide+resolution+from+brain+tissues.">Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues.</a> Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).</li><li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method.">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li><li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine.">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li><li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues.">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li><li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing.">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 6 (1), 33 (2013).</li><li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology:+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition.">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Adey, A., Shendure, J. U. l. t. r. a. -. l. o. w. -. i. n. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing.">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li><li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity.">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation.">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39 (2011).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes.">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).</li><li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

المقايضة يسمح للركزت ودقيقة الكميات مثيلة الحمض النووي مع قدرات إنتاجية عالية في كل من عدد من العينات وعدد من الأهداف. بالإضافة إلى ذلك، هذا الجيل المكتبة باستخدام بوساطة transposome tagmentation يتطلب أقل DNA المدخلات، وأسرع وعلى خطوات أقل من القص التقليدي والتقنيات محول ربط لاحقة. هذه التحسينات على أساليب القائمة تسمح الدقيق على مستوى قاعدة تحليل الحامض النووي من أي هدف من الفائدة. وعلاوة على ذلك، المقايضة يوفر طريقة جديدة للحصول على تأكيد من المناطق ذات الاهتمام (المناطق مثيلة تفاضلي (DMRS)، والجزر الدليل السياسي الشامل، والمناطق التنظيمية) التي تم تحديدها باستخدام الجينوم كله بيسلفيت 22 أو 23 التقاط النهج. باستخدام نهج تأكيدا المتعامدة وأكثر الأساليب الكمية دقيقة يحسن الدقة التحليلية الدراسات epigenomic. عمق قراءة عالية تحقق مع المقايضة يسمح الكميات دقيقة في فاصل الثقة الضيق، وإعادةsulting في الكميات الدقيقة 16. بالإضافة إلى ذلك، والقدرة على تشغيل العديد من العينات في تجربة واحدة يمكن أن تزيد من حجم العينة لتأكيدات وسائل الجينوم كاملة، الأمر الذي سيزيد من قوة الإحصائية؛ نقطة ضعف العديد من الدراسات جينية الحالية. الأهم من ذلك، يوفر المقايضة على الدليل السياسي الشامل مثيلة الكميات قاعدة محددة، والذي يسمح لتوليد فرضيات قابلة للاختبار للأبحاث جينية. سوف فرضيات مثل زيادة مثيلة في عنصر استجابة محددة يؤدي إلى انخفاض ملزمة للعامل النسخ محددة. المقايضة، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير مرنا مقترن، يوفر طريقة للحصول على كل من التنظيم جينية ومرنا التعبير في قطعة واحدة من نسيج أو خلية السكان. قياسات يقترن التنظيم والتعبير أيضا أن يزيد من الدقة العلمية وتأثير النتائج. وتشمل الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكول المقايضة التصميم التمهيدي، amplicon الأمثل، وتوليد مكتبة /QC. هو عرض PCR التحيز إذا لم يتم تصميمها بشكل صحيح الاشعال وتضخيم في الكفاءات المختلفة 8. استخدام المعايير مثيلة، مثل لدت إنزيمي 100٪ و 0٪ السيتوزين ميثليته المعايير، ويمكن استخدامها لتحديد درجة، إن وجدت، من التحيز مثيلة الكميات، وهو السيطرة المنهجية المناسبة عند قياس مثيلة 16. وبالمثل، ينبغي توخي الحذر عند تحسين ردود الفعل PCR لتوليد واحد amplicon ذات جودة عالية. إذا لم يكن هناك amplicon هو الحاضر باستخدام المبادئ التوجيهية المقترحة مفصل في البروتوكول، وتشمل الخطوات الأمثل أعداد متزايدة دورة PCR أو bsDNA كمية المدخلات. إذا كانت هناك منتجات PCR متعددة، بما في ذلك التمهيدي-dimers، وتشمل الخطوات الأمثل خفض كمية المدخلات bsDNA، وخفض PCR التمهيدي تركيزات المدخلات المولي، وزيادة درجات الحرارة الصلب، أو خفض عدد PCR دورة. واحد أو مزيج من هذه الإجراءات تحسين غلة النتائج كافية لتوليد المهزومة واحدح-نوعية amplicon. بدلا من ذلك، إعادة تصميم الاشعال هو نهج جيد لمجموعات التمهيدي التي لا تسفر عن amplicon واحد. لتلك المناطق حيث إعادة تصميم غير مناسب أو ممكن، تتحول مجموعات التمهيدي بما في ذلك قد تعمل السيتوزين والثايمين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال إلى الأمام والأدينين والجوانين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل في الاشعال العكسية. ومع ذلك، هذه المجموعات التمهيدي تحتاج إلى مزيد من التحسين لضمان عدم التحيز PCR يحدث، وهي عملية خارج نطاق هذا البروتوكول. المكتبات الجودة هي في غاية الأهمية للنجاح. ضمان أن تكون التدابير QC تتم لتحديد حجم ونوعية وكمية من المكتبات قبل التسلسل. ردود الفعل التسلسل عرضة للفشل مع مدخلات من المكتبات ذات جودة منخفضة. التحيز في مثيلة الكميات يمكن تخفيفها عن طريق ضمان أن الترددات مثيلة موجودة في كل من الأمام وعكس يقرأ التسلسل. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن عشرات نوعية قواعد التوفيق إلى مواقع الدليل السياسي الشامل يكون ≥Q30 لارتفاع شاركnfidence في الكميات. في حين أن آخرين قد أظهرت قليلا في وقت سابق الى أي تحيز في التفاعلات tagmentation من الحمض النووي تحويل بيسلفيت 19، وضمان المقاييس المذكورة أعلاه يسمح للتأكيد منخفضة التحيز مثيلة الكميات. يقيس المقايضة حاليا مثيلة في مواقع الدليل السياسي الشامل، ومع ذلك، فإن التوسعات المستقبلية لهذه الطريقة تسمح القياسات الموثوقة من الدليل السياسي الشامل 5-مؤسسة حمد الطبية مع إضافة من الخطوات التجريبية التمييز بين 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية مثل إدخال perruthenate البوتاسيوم قبل التحويل بيسلفيت 24. سيؤدي هذا إلى زيادة تأثير المقايضة فائدة من خلال السماح للمثيلة مقترن، على حد سواء 5-مولودية و5-مؤسسة حمد الطبية، والبيانات التعبير من أجل تحديد الأدوار التنظيمية التعبير الجيني من الحامض النووي. إعداد مكتبة Transposome بوساطة من amplicons PCR لا يؤدي إلى انخفاض عمق التسلسل في نهايات المناطق تضخيمها. ولذلك، ينبغي أن تصمم مناطق فائدة مرتفعة للإقامة في وسط amplicons. كيفمن أي وقت مضى، لأن المقايضة يولد قراءة التسلسل أعماق&gt; 1،000 X، دقة كمية من 5-MC القياسات بالقرب من أقاصي المناطق تضخيم لا تزال مرتفعة.

بعد مضي أكثر من نصف قرن منذ التقرير الأول للتحدث بشكل طبيعي التعديلات DNA على شكل السيتوزين مثيلة 1. السيتوزين مثيلة هو قاعدة السيتوزين النوكليوتيدات المعدلة حيث الكربون 5 عشر على عصابة القاعدة لديه مجموعة الميثيل (5-MC)، تحدث في اغلب الاحيان في ثنائي النوكليوتيد عزر الدليل السياسي الشامل في جينومات الثدييات. وجود وظيفي من 5-MC في المروجين الجين يرتبط عموما القمع النسخي، في حين يرتبط غياب النشاط مع النسخي 2. وقد تم إحراز تقدم هائل في فهمنا لدور الحامض النووي في التنمية 3، نشر transgeneration لمحات جينية 4، والسرطان المرضية 5،6، وعدد من المجالات البحثية الأخرى. وصلنا العديد من هذه الإنجازات في السنوات القليلة الماضية حيث تم تطوير منهجيات جديدة للصفحة الشخصية DNA مثيلة 7. مع ظهور وتعميم من الجيل المقبل من التسلسل (NGS) تقنيات وهناك الآن عدد من الطرق للصفحة الشخصية الحامض النووي عبر الجينوم بأكمله أو مناطق واسعة من الجينوم 8. هذه النهج تفتح إمكانية اكتشاف الدراسات التي تقيس كمية DNA أنماط مثيلة والاختلاف في الحامض النووي. وبالإضافة إلى هذه الأساليب المولدة للفرضية، هناك حاجة كبيرة لاستهداف / فرضية DNA اختبار طرق مثيلة الكميات. وكانت سلسلة البايرو، مثيلة PCR معين، وتسلسل سانجر المباشر للDNA تحويل بيسلفيت الطرق الأكثر استخداما لتحليل المناطق المستهدفة (أي منطقة المروج من جين واحد أو جزيرة الدليل السياسي الشامل) 9-12. كل من هذه الطرق تعتمد على تحويل بيسلفيت، وهو رد فعل نزع الأمين الكيميائي حيث يتم تحويلها لالسيتوزين unmethylated إلى اليوراسيل، في حين لا تزال في السيتوزين ميثليته سليمة 13،14. PCR التضخيم من bisulfite-نتائج فحص الحمض النووي المحولة في استبدال واليوراسيل مع الثايمين 15 السماح للمثيلة التفاضلية لقراءة بها باعتبارها الفرق القاعدة. بينما مفيدة للغاية، والقيود المفروضة على هذه الطرق تشمل منخفضة الدقة الكمية، طول قراءة القصير، وانخفاض الإنتاجية عينة. لمعالجة هذه القيود قمنا بتطوير طريقة لدينا وصف بيسلفيت Amplicon تسلسل (المقايضة) 16. والهدف من هذه الطريقة هو أن تكون قادرة على تحليل المناطق الجينومية الهدف من الفائدة في عدد كبير من العينات بدقة كمية عالية. يستخدم المقايضة عناصر من الأساليب القائمة (تحويل بيسلفيت والخاصة بكل منطقة التضخيم PCR) ويجمعها مع الجيل المقبل بسيط البناء مكتبة (بوساطة transposome) 17 والفوق NGS 18 (الشكل 1). ويوفر هذا النهج لطريقة الإنتاجية أكثر الكمي والتعليم العالي لدراسة مثيلة السيتوزين في أي منطقة من الفائدة. هنا نقدمطريقة بالتفصيل ووصف النهج لاستكشاف وفحص الجودة في عملية المقايضة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

المقايضة يقرأ محاذاة بشكل صحيح إلى تسلسل إشارة تحويله سوف تشبه الشكل 5. يمكن بوضوح أن تحدد dinucleotides الدليل السياسي الشامل ويمكن تقدير دول مثيلة من خلال مراقبة المكالمات قاعدة في مواقع الدليل السياسي الشامل في تعيين يقرأ. على سبيل المثال، مع وجود ضوابط مثيلة، و0٪ مثيلة يؤدي في جميع يقرأ تعيينها إلى مواقع تحتوي على الدليل السياسي الشامل T في (الشكل 5A). سوف الضوابط مثيلة 100٪ ينتج في جميع يقرأ معين يقرأ إلى مواقع تحتوي على الدليل السياسي الشامل C في (الشكل 5B). الكميات من التردد السيتوزين (C / C + T) في مواقع الدليل السياسي الشامل غلة تردد مثيلة في العينة الأصلية. منحنى مستوى تمثيلي المتولدة من الضوابط كلها الجينوم مثيلة (ن = 3 / نسبة الحامض) ويظهر الخطي من مثيلة الكميات وكذلك الدقة في تحديد الكميات في كل نسبة الحامض (الشكل 6). وكمثال على هذا الأسلوب في المجموع، وكانت RNA والحمض النووي شارك في ايزو<html> ذا الصلة من المخيخ الماوس وشبكية العين (ن = 4 / المجموعة). رودوبسين التعبير، أعرب انتقائي في أنسجة الشبكية، تم قياسها باستخدام QPCR. تم الكشف عن التعبير فقط في شبكية العين (الشكل 7A). عن طريق المقايضة، تم كميا مستويات الحامض الدليل السياسي الشامل في المنطقة رودوبسين المروج. وكانت مستويات الحامض التراكمية عبر منطقة المروج&gt; 80٪ في المخيخ مقارنة &lt;15٪ في شبكية العين (ع &lt;0.001، حدودي اختبار t) (الشكل 7B). ويمكن مقارنة المقايضة مثيلة الكميات فوائد من موقع محدد مثيلة الكميات، ومستويات الحامض على أساس الدليل السياسي الشامل محددة عبر أي منطقة الجينومية معين. وكانت مستويات الحامض الدليل السياسي الشامل عبر المروج رودوبسين أعلى بكثير في عينات للدماغ عند مقارنة عينات الشبكية (P &lt;0.001، حدودي اختبار t في كل موقع الدليل السياسي الشامل) (الشكل 7C). 1highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: رسم تخطيطي للطريقة المقايضة في هذه الطريقة، الحمض النووي الجيني هو بيسلفيت تحويلها إلى تعديل cytosines unmethylation إلى uracils. وفي وقت لاحق، خلال PCR يتم تغيير هذه uracils إلى thymines. يتم توجيه PCR التضخيم ضد المناطق ذات الاهتمام ويثري للغاية لمجرد هذه المتتاليات. مصنوعة الناتجة amplicons PCR في المكتبات المزدوجة فهرستها من خلال عملية tagmentation بسيطة. وفي وقت لاحق والتسلسل المكتبات على الفوق الجيل القادم المنظم والتسلسل يقرأ يتم تعيينها لفي سيليكون وتحويلها تسلسل المرجعية والمئة مثيلة من يتم تحديد السيتوزين بطريقة قاعدة محددة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> الشكل 2: في سيليكون وتحويل بيسلفيت من المنطقة من اهتمام أي منطقة من الاهتمام من أي إشارة الجينومية يمكن أن يكون SELECتيد لفي سيليكون وتحويل بيسلفيت. يتم استبدال cytosines غير الدليل السياسي الشامل مع الثايمين في تسلسل المرجعية. تبقى cytosines الدليل السياسي الشامل تحويل cytosines في بيسلفيت المرجعية. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> الشكل (3): تم تصميم الاشعال التنسيب التمهيدي بيسلفيت PCR ضد في سيليكون بيسلفيت تحويلها تسلسل المرجعية. الاشعال هي أن تكون مصممة بحيث لا تتداخل dinucleotides CG أو تصميم المتاخمة لdinucleotides CG. <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> الشكل 4: أمثلة من amplicons العالية وسوء نوعية PCR والمكتبات التسلسل آثار رحلاني التمثيلية وتظهر هلام (A) amplicon المثالي لتوليد مكتبة بوساطة transposome مع ارتفاع وحيد.<html> المنتج التركيز. (B) مكتبة المتولدة من هذه amplicon يبين تركيز عال، وحتى حجم التوزيع. يمكن (C) سوء نوعية amplicons PCR تكون منخفضة في الحجم، والتركيز، وتحتوي على منتجات متعددة و / أو dimers التمهيدي. وستكون هذه amplicons نوعية رديئة تؤدي إلى (D) فشل الجيل مكتبة مع انخفاض تركيز وتوزيع حجم صغير. <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> الشكل 5: أمثلة من مخرجات التسلسل من الضوابط مثيلة. (A) في سيليكون وتحويلها التسلسل المرجعي مع المواقع الدليل السياسي الشامل أبرز باللون الأحمر. السيطرة مثيلة 0٪ معين يقرأ للمنطقة تظهر thymines مختارة (الجشع تمييز) رسم الخرائط في مواقع الدليل السياسي الشامل. التحكم (B) 100٪ مثيلة معين يقرأ تظهر (تسليط الضوء الأزرق) رسم الخرائط السيتوزين لفي مواقع الدليل السياسي الشامل. together.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" /> الشكل 6: الكميات مثلأيشن عبر مجموعة من الضوابط مثيلة الضوابط مثيلة جينوم كامل مختلطة في نسب مثيلة (ن = 3 / نسبة) من 0٪ الى 100٪ وتم قياس كمية باستخدام المقايضة. بالتآمر الكميات المتوقعة مقابل كميا يدل الخطي من السيطرة مثيلة الكميات. عبر جميع الضوابط، كان هناك دقة عالية في مثيلة الكميات. <img alt="الرقم 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> الرقم 7: مثال لتقرن الحامض النووي والتعبير الجيني من تحليل عينات الأنسجة. (A) رهودوبسن] التعبير مرنا نسبيا من المخيخ الماوس والأنسجة الشبكية. (B) رهودوبسن] متوسط ​​مثيلة المروج كميا عن طريق المقايضة بين المخيخ والحمض النووي في شبكية العين (*** P &lt;0.001، حدودي اختبار t). &lt;قوية&gt; مستويات الحامض C) الدليل السياسي الشامل الموقع المحدد عبر المروج رودوبسين (-244 إلى +6، نسبة إلى موقع بداية النسخ [TSS]) في المخيخ الماوس وDNA شبكية العين.

Watch this Scientific Journal Video about Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing at JoVE.com

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

استهدفت DNA تحليل مثلأيشن من قبل الجيل المقبل من التسلسل

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Video: Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

الحامض النووي : Bisulphite تعديل وتحليل

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

الجيل المقبل من تسلسل خاص بالريبوسوم 16S RNA جين Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

المحسن انخفاض التمثيل بيسلفيت تسلسل لتقييم الحامض النووي في قرار قاعدة زوج

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

إينتيراكتومي--Seq: بروتوكول لبناء مكتبة دومينومي والتحقق منها واختيار عرض بالعاثية وتسلسل الجيل القادم

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high quality and quantity DNA from a well-preserved individual mosquito sufficient for downstream whole genome sequencing. However, reliance on an expensive automated DNA extraction instrument can be prohibitive for many laboratories. Here, the study provides a budget-friendly magnetic-bead-based DNA extraction protocol, which is suitable for low to medium throughput. The protocol described here was successfully tested using individual Aedes aegypti mosquito samples. The reduced costs associated with high quality DNA extraction will increase the application of high throughput sequencing to resource limited labs and studies.

Described here is a DNA extraction protocol using magnetic beads to produce high quality DNA extractions from mosquitoes. These extractions are suitable for a downstream next-generation sequencing approach.

بروتوكول استخراج الحمض النووي للبعوض القائم على الخرز المغناطيسي لتسلسل الجيل التالي

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...