Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dell'epigenomica dimostrando come progettare e implementare uno strumento basato sul sequenziamento per valutare l'impatto dei fattori ambientali sulla metilazione del DNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può fornire un metodo più completo e quantitativo per valutare i livelli di metilazione del DNA rispetto alle piattaforme basate su array. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'identificazione dei cambiamenti di metilazione del DNA dovuti a diversi tipi di processi fisiologici in qualsiasi organismo i cui dati di sequenza sono disponibili.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'impatto dello stress sulla metilazione del DNA, può anche essere applicato ad altri fattori ambientali o condizioni fisiologiche, come l'esposizione a sostanze tossiche ambientali nella dieta ricca di grassi e condizioni come diabete e malattie cardiovascolari. Dopo aver tranciato il DNA e verificato le dimensioni tramite bioanalizzatore, aggiungere 180 microlitri di perline magnetiche leganti il DNA a ciascun campione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Pellettare le perline su una piastra magnetica e rimuovere il supernatante.
Riutilizza il pellet in 200 microlitri di 70%etanolo. Quindi, utilizzare una piastra magnetica per pellettare le perline e rimuovere il più possibile l'etanolo. Asciugare le perline in un blocco di calore a 37 gradi Celsius per tre o cinque minuti.
Quindi, rimescolare il pellet in 44 microlitri di acqua priva di nucleasi e raccogliere circa 42 microlitri del supernatante. Dopo aver legato gli adattatori e verificato la legatura tramite bioanalizzatore, trasferire i campioni in tubi a microcentrifugo a basso legame del DNA. Quindi, utilizzare un concentratore di vuoto riscaldato per ridurre il volume del campione al di sotto di 3,4 microlitri.
Successivamente, aggiungere 5,6 microlitri di Methyl-Seq Block Mix a ciascun campione e incubarli in un ciclore termico. Preparare Capture Library Hybridization Mix in base al protocollo di testo. Quindi, aggiungi 20 microlitri di Capture Library Hybridization Mix a ogni campione e incuba a 65 gradi Celsius per 16 ore.
Verso la fine del periodo di incubazione, preparare perline magnetiche streptavidin aggiungendo 50 microlitri di perline magnetiche streptavidin per campione a un nuovo tubo a strisce a otto pozzi. Lavare le perline con 200 microlitri di Buffer leganti Metil-Seq. Posizionare il tubo a strisce su una piastra magnetica e rimuovere il supernatante dalle perline.
Quindi, rimospendare le perline in 200 microlitri di Methyl-Seq Binding Buffer. Aggiungere i campioni alle perline di streptavidina lavate e incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti su un miscelatore rotante. Mentre i campioni si mescolano, aliquota 200 microlitri di Metil-Seq Wash Buffer Two in pozzi triplicati di una piastra da 96 porri e pre-caldi a 65 gradi Celsius.
Dopo che i campioni incubano, pellet le perline magnetiche con una piastra magnetica e rimuovere il supernatante. Quindi, rimospendare le perline in 200 microlitri di Metil-Seq Wash Buffer One. Incubare le perline per 15 minuti a temperatura ambiente e utilizzare una piastra magnetica per rimuovere il supernatante.
Successivamente, rimospendare il pellet di perline in 200 microlitri di Tampone di lavaggio due pre-riscaldato. Quindi, incubare le perline in un ciclore termico prima di utilizzare una piastra magnetica per pelletare le perline. Aggiungere 20 microlitri di Methyl-Seq Elution Buffer alle perline lavate e incubarli a temperatura ambiente per 20 minuti.
Utilizzare una piastra magnetica per pelletare le perline e trasferire il supernatante su un nuovo tubo a strisce. In primo luogo, aggiungere 130 microlitri di reagente di conversione della bisulfite al supernatante precedentemente raccolto. Dividere equamente le reazioni a 150 microliter in due pozzi.
Quindi, incubare le reazioni in un ciclore termico. Utilizzare 600 microlitri di Binding Buffer per legare i campioni alle colonne di rotazione e lavare le colonne con 100 microlitri di Wash Buffer. Quindi, centrifuga le colonne e scarta il flusso.
Successivamente, aggiungere 200 microlitri di Buffer di desolfonazione alle colonne. Incubare le colonne per 15-20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le colonne due volte con 200 microlitri di Wash Buffer.
Quindi, aggiungere 10 microlitri di Elution Buffer alla colonna. Incubare a temperatura ambiente e centrifugare. Preparare il mix di master reazioni PCR in base al protocollo di testo.
Quindi, aggiungere 82 microlitri della miscela master a ciascun campione e incubare i campioni in un ciclore termico. In primo luogo, preparare il PCR Master Mix Two sul ghiaccio secondo il protocollo di testo. Quindi, per ogni campione, aggiungere 25,5 microlitri di PCR Master Mix Two e cinque microlitri di primer di indicizzazione commerciale e incubare i campioni in un ciclore termico.
Valutare la concentrazione di DNA dei campioni con reagenti di rilevamento del DNA ad alta sensibilità su un bioanalizzatore. Le librerie Metil-Seq vengono quindi inviate per il sequenziamento sul sequencer di nuova generazione. Dopo la conversione della bisulfite e l'amplificazione dei campioni di convalida della PCR, preparare un master mix con perline di sefarose rivestite con Binding Buffer, acqua e streptavidina.
Quindi, aggiungere 75 microlitri del mix principale e cinque microlitri del prodotto PCR annidato a una piastra da 96 po 'e agitare la piastra su uno shaker per 15-60 minuti. Mentre la piastra trema, aggiungere 12 microlitri di primer ai pozzi di una piastra di dosaggio pirosequencing. Dopo aver tremato, posizionare uno strumento sottovuoto in un trogolo riempito d'acqua, quindi posizionare l'utensile nella piastra con reazioni di legame.
Successivamente, immergere lo strumento sottovuoto in trogoli semicompilati contenenti 70%etanolo, idrossido di sodio e tampone tris-acetato. Scollegare il vuoto e posizionare l'utensile sottovuoto nella piastra di dosaggio pirosequencing HS per trasferire le perline. Posizionare la piastra su un blocco di calore e incubare a 80 gradi Celsius per due minuti.
Infine, lasciare raffreddare la piastra per cinque minuti prima di iniziare il programma piro. In questo protocollo, l'analisi delle biblioteche metil-seq forniva un elenco classificato di regioni metilate differenziali, o DMOR, tra animali stressati e non stressati e un grafico dei DMOR. La convalida tramite piroscoquestro di bisulfite ha mostrato che gli animali stressati mostravano tutti livelli di metilazione più elevati in tutti i CPG rispetto agli animali non stressati.
Anche i livelli di metilazione a CpG 10 sono stati confrontati con i livelli media di CORT di tre settimane per ciascun animale. I risultati indicano che esiste una modesta correlazione tra i dati endocrini e metilazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confrontare l'aumento della dimensione media del DNA tra la tosatura del DNA e i passaggi di legatura dell'adattatore e di garantire una quantità sufficiente della libreria prima del sequenziamento.
Seguendo questa procedura, altri approcci simili possono essere implementati al fine di rispondere a nuove domande, come l'impatto dei tossicosi ambientali sul neurosviluppo dei topi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha fornito i mezzi per i ricercatori nel campo dell'epigenetica per esplorare i cambiamenti di metilazione del DNA a livello genomico in qualsiasi organismi non modello o modello in cui sono disponibili sequenze genomiche. Non dimenticare che lavorare con gli enzimi sensibili alla temperatura richiede lo stoccaggio sul ghiaccio durante l'uso e lo stoccaggio nel congelatore meno 20 gradi.
Le perle di RNA utilizzate per la cattura del bersaglio richiedono lo scongelamento e lo stoccaggio sul ghiaccio durante l'uso e lo stoccaggio a lungo termine nel congelatore meno 80 gradi.
