يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة التفاعلات المضيفة المسببة للأمراض من خلال السماح بفحص التعبير RNA الترميز وغير الترميز الفيروسية المشاركة في الاستجابة الأمينية المضيفة وكذلك كيف يمكن لمسبب الأمراض أن يؤثر على الوظائف البيولوجية للمضيف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة مرنا وRNA غير الترميز من مكتبات RNAseq RNAAseq خفض الجلوبيين من عينة دم كاملة واحدة. إثبات هذه التقنية ستكون سارة أندرسون، فني من مختبري.
ابدأ بالطرد المركزي لأنابيب الدم عند 50 20 مرة من G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، بعد إزالة ناظر، إضافة ثمانية ملليلتر من المياه الخالية من RNase إلى بيليه. إغلاق الأنابيب ودوامة بيليه حتى يتم حل واضح، ثم الطرد المركزي الأنابيب في 50 20 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لاسترداد بيليه.
العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، والتخلص من عظمى وحفظ بيليه. لعزل الجيش الملكي النيبالي الكلي، تبدأ pipetting 300 microliters من عازلة ملزمة تحلل إلى بيليه. بعد دوامة، ونقل الخليط من كل أنبوب إلى جديد المسمى 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي.
إضافة 30 ميكروليتر من المضافة المتجانسة من مجموعة العزل ميرنا. دوامة الأنابيب ومكان على الجليد لمدة 10 دقائق. العمل في غطاء الدخان، وإزالة الأنابيب من الجليد وإضافة 300 ميكرولترات من كاشف الكلوروفورم الفينول الحمضية من عدة ودوامة مرة أخرى لخلط.
بعد الطرد المركزي في 10، 000 مرات G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة بعناية مرحلة مائي إلى أنبوب جديد. بناء على كمية الانتعاش مائي من الخطوة السابقة، إضافة 1.25 مرات حجم 100٪ الإيثانول إلى phage مائي في كل أنبوب وماصة لخلط. قم بإعداد أنابيب جمع جديدة تحتوي على خرطوشة فلتر لكل عينة.
ما يقرب من 675 ميكرولترات من خليط lysate الإيثانول على خرطوشة مرشح. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة في 10،000 مرات G لتمرير السائل من خلال مرشح. تجاهل التدفق من خلال.
كرر خليط lysate-الإيثانول إضافة إلى مرشح والطرد المركزي حتى تم استخدامه بالكامل. أضف 700 ميكروليتر من محلول الغسيل واحد من المجموعة إلى خرطوشة التصفية. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لسحب الحل من خلال المرشحات.
تجاهل التدفق من خلال والحفاظ على نفس خراطيش التصفية وأنابيب الجمع. أضف 500 ميكرولترات من محلول الغسيل 2-3 لكل خرطوشة تصفية. بعد الطرد المركزي مرة أخرى، تجاهل تدفق من خلال وتكرار خطوة الغسيل.
لإزالة أي سائل متبقي من خراطيش التصفية، قم ب تدويرها 60 ثانية إضافية. قم بنقل الخراطيش إلى أنابيب تجميع جديدة. أضف 100 ميكروليتر من 95 درجة مئوية من المياه الخالية من النوى إلى مركز كل خرطوشة مرشح.
أجهزة الطرد المركزي خراطيش لمدة 20 إلى 30 ثانية تقريبا في جهاز الطرد المركزي الطاولة في السرعة القصوى. لتشجين ما قبل مع oligos الحد من الجلوبيين، وتشويه الأول الجيش الملكي النيبالي عن طريق إضافة كل عينة المستخرجة في أنبوب تفاعل 0.2 milliliter رقيقة الجدران النوكلاز خالية من النيوكلاز. ضع الأنابيب في دورة حرارية عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
بعد ذلك، ضع على الفور الأنابيب على الجليد للحصول على نوعية الحمض النووي الريبي الأمثل. في حين أن الأنابيب هي التبريد، وإعداد 400 ميكرولترات من 10X غلوبين الحد من أوليجو مزيج و10X oligo التهجين العازلة في أنبوب ملليلتر اثنين. لجعل مزيج التهجين، إضافة ستة ميكروغرام من عينة RNA، واثنين من ميكرولترات من 10X الغلوبين الحد من oligo مزيج، واحد ميكرولتر من 10X oligo العازلة التهجين، والنوى المياه الحرة إلى حجم النهائي من 10 ميكرولترات لكل 0.2 ملليلتر رقيقة الجدران، نوكلاسي خالية من أنبوب التفاعل.
ضع الأنابيب في دورة حرارية عند درجة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك، ضع الأنابيب على الجليد على الفور. لأداء عملية الهضم RNase H، قم أولاً بتخفيف 10X RNase H إلى X RNase H مع واحد X RNase H buffer.
إعداد RNase H مزيج التفاعل من خلال الجمع بين اثنين من microliters من 10X RNase العازلة، واحد ميكرولتر من مثبط RNase، واثنين من ميكرولترات واحدة من RNase H، وخمسة ميكرولترات من المياه الخالية من النيات إلى حجم إجمالي قدره 10 ميكرولترات. إضافة 10 ميكرولترات من مزيج RNase H رد فعل إلى عينات التهجين الحد من الجلوبيين ومزيج دقيق. استوعب رد الفعل هذا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم يبرد إلى أربع درجات مئوية.
وقف الهضم عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من 0.5 EDTA المول إلى الأنبوب، ونقل المحتوى بأكمله من الأنبوب إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. مباشرة بعد ذلك، إضافة 80 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase، 350 ميكرولترات من العازلة تحلل، ثم 250 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى كل أنبوب وخلط جيدا عن طريق الأنابيب. نقل كل عينة ميكرولتر 700 إلى خرطوشة تصفية elution منفصلة وضعت في أنبوب جمع مليلتر لجمع تدفق من خلال.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 ثانية في 8،000 مرة G أو أكبر ومن ثم تجاهل تدفق من خلال. ضع خراطيش تصفية elution نفسها في أنابيب جمع ميليلتر جديدة. لغسل أغشية خرطوشة المرشح، أضف 500 ميكرولترات من مخزن الغسيل الخفيف إلى خراطيش الترشيح والطرد المركزي لمدة 15 ثانية عند 8000 مرة من G أو أكثر.
تجاهل التدفق من خلال. ثم، باستخدام نفس أنابيب جمع، إضافة 500 ميكرولترات من 80٪ الإيثانول لخراطيش تصفية. جهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين في 8،000 مرة G وأكبر.
تجاهل كل من تدفق من خلال وجمع أنابيب، وحفظ أعمدة تدور elution. ضع كل عمود دوران elution في أنبوب جمع مليلتر جديد. جهاز طرد مركزي في سرعة كاملة لمدة خمس دقائق مع غطاء مفتوح على خراطيش تصفية لتجفيف أغشية العمود تدور ومنع نقل الإيثانول.
بعد التخلص من أنابيب التجميع، ضع كل خرطوشة تصفية مجففة في أنبوب جمع جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 14 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى مركز غشاء خرطوشة التصفية. ل elute الجيش الملكي النيبالي، الطرد المركزي الأنابيب لمدة 60 ثانية بأقصى سرعة ومن ثم الاستمرار في مزيد من تقييم الحمض النووي الريبي وإعداد.
ويمكن الآن تقسيم العينة المنضب الجلوبيين واستخدامها لإعداد مكتبات الحمض النووي الريبي الصغيرة وغير الترميزية وكذلك مكتبة الحمض النووي الريبي المنضب ومكتبات الحمض النووي الريبي الطويلة وغير الترميزية. بعد إعداد مكتبات التعبير من عينات الدم الكاملة المنضبة من الجلوبيين والمنضبة ريبو باستخدام هذا البروتوكول، أظهر ملخص تشغيل ملف electrophoresis عينة مكتبة مستنفدة بالغلوبين بأرقام تكامل RNA التي تراوحت من 6.3 إلى 9.2. وقد ثبت أن هذا التحسن كان تحسنا بالمقارنة مع الدراسات الأخرى التي استخدمت أساليب استنفاد الغلوبين ولم تتمكن إلا من تحقيق أرقام RIN عند أو قرب ستة.
أظهر ما قبل الغلوبين- تخفيض ما بعد الجلوبيين لعينة دم كاملة واحدة بورسين أن 260 إلى 280 نسب تركيز نانومتر هي في أو أكثر اثنين. وباستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على كهربية ذات رقائق من عينات مكتبة مرنا الدم الكاملة المنضبة بالغلوبين والربو قبل التجميع والتسلسل. بالنسبة لمكتبات مرنا، يكون المخطط الكهربائي التمثيلي ذروة في حوالي 280 زوجاً من اللغات الأساسية.
بالنسبة لـ ncRNAs الممثل كهربية ذات أساس رقاقة صغيرة تحتوي على مجموعة من القمم من حوالي 100 إلى 400 زوج قاعدة. 22 - وتتطابق القمم عند 143 زوجاً من أزواج القاعدة تقريباً مع الـ miRNAs، وتبلغ الذروة حوالي 153 زوجاً من أزواج الأساسات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن نتذكر أنابيب الثلج على الفور حيث لوحظ.
وفي أعقاب هذا الإجراء، ينبغي تنفيذ طرق أخرى مثل تسلسل الجيل التالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التعبير التفاضلي، والتغيرات اللاجينية، وتأثيرها على المسارات والعمليات البيولوجية. لا ننسى أن العمل مع مُكشف الفينول-كلوروفورم خطير للغاية وينبغي اتخاذ احتياطات مثل العمل في غطاء الدخان. أيضا، عند التعامل مع الدم الكامل أو الكائنات المعدية، ينبغي أن يتم تنفيذ العمل في خزانة السلامة البيولوجية قبل تنشيط الكائن المعدي.
