الجيل الثالث نانوبور التسلسل هو تكنولوجيا تسلسل رواية قوية التي تسمح بسهولة جدا الحصول على معلومات التسلسل من مجموعة واسعة من العينات. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي قابلية جهاز التسلسل وطول القراءة الطويل للغاية وتوافر البيانات في الوقت الفعلي. تسلسل النانوبور هو تكنولوجيا مفيدة بشكل خاص خلال تفشي الأمراض في المناطق النائية.
وقد تم استخدامه بنجاح في المختبرات الميدانية أثناء وبعد فاشيات فيروس الإيبولا في غرب ووسط أفريقيا. عبر تسلسل نانوسبور واستخدام جهاز MinION لهذا الغرض هو سهل نوعا ما، يجب توخي الحذر أثناء إعداد المكتبة وأثناء تحميل الخلايا تدفق. لبدء هذا الإجراء، إعداد هبوط PCR لتضخيم cDNA مع التمهيدي تعيين واحد باستخدام بداية ساخنة عالية الدقة الحمض النووي البوليمرات مع العازلة التفاعل المناسبة في حجم رد فعل ميكرولتر 50 مع قالب ميكرولتر واحد.
إذا كان ذلك ممكنا، إعداد رد فعل على الجليد أو في كتلة باردة في أربع درجات مئوية. احتضان رد الفعل في ثيرموسكلتر كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل 50 ميكرولترات من المنتج PCR إلى 1.5 ملليلتر الحمض النووي أنبوب رد فعل ملزمة منخفضة.
resuspend الخرز المغناطيسي بدقة عن طريق دوامة. ثم إضافة 50 ميكروليتر من الخرز إلى تفاعل PCR ومزيج جيد. احتضان العينة على خلاط دوار لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة أثناء الدوران عند 15 دورة في الدقيقة.
تدور لفترة وجيزة أسفل العينة ومن ثم وضع الأنبوب على رف مغناطيسي لبيديه الخرز المغناطيسي. انتظر حتى تم توضيح المابير تماما قبل المتابعة. المقبل، الطامح الماكر دون إزعاج بيليه حبة والتخلص منه.
Pipette 200 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول في أنبوب رد الفعل واحتضان لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. استلهم الإيثانول دون إزعاج حبيبة الخرز والتخلص منه. كرر عملية الغسيل هذه مع الإيثانول مرة أخرى لمجموع اثنين من الغسالات.
الهواء يجف بيليه لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة أنبوب التفاعل من رف المغناطيسي. Resuspend بيليه في 30 ميكرولترات من المياه الحرة النوى واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
وضع أنبوب رد الفعل مرة أخرى على رف المغناطيسي والانتظار حتى يتم بيليه تماما حبات رد الفعل. بعد هذا، إزالة ناظر دون إزعاج بيليه ونقلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 ملليلتر جديدة. إذا كان من المقرر أن تُتسلسل عدة عينات في نفس الوقت، يمكن الآن إضافة الباركود بواسطة خطوتين إضافيتين من PCR متبوعتين بتنظيف الحمض النووي كما هو مبين سابقاً.
أولاً، الجمع بين كمية مساوية من الحمض النووي المكرق من كل عينة لما مجموعه ميكروغرام واحد من الحمض النووي في حجم 45 ميكرولتر في أنبوب تفاعل 0.2 ملليلتر. لdA-الذيل، إضافة سبعة ميكرولترات من نهاية العازلة رد فعل الإعدادية، وثلاثة microliters من مزيج إنزيم الإعدادية نهاية، وخمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوكلاز. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط.
في دراجة الحرارة، احتضان رد الفعل لمدة خمس دقائق في 20 درجة مئوية تليها خمس دقائق في 65 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بإجراء تنقية PCR لمنتج التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص. اختياريا، تأخذ ميكرولتر واحد لتحديد تركيز العينة باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
الجمع بين 22.5 ميكرولترات من الحمض النووي المنقى التي تم الحصول عليها سابقا مع 2.5 ميكرولترات من محول 1D2 و 25 ميكرولترات من بلانت / تا Ligase ماجستير ميكس في جديد 1.5 ملليلتر الحمض النووي انخفاض تفاعل أنبوب. نفض الغبار بلطف أنبوب لخلط. تدور لفترة وجيزة أسفل الخليط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
ثم قم بإجراء تنقية PCR لمنتج التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص. الجمع بين 45 ميكرولتررس من المنتج رد فعل مع خمسة ميكرولترات من مزيج محول الباركود و 50 ميكرولترات من بلانت / تا Ligase ماجستير ميكس في أنبوب رد فعل منخفض الحمض النووي ملزمة. نفض الغبار بلطف لخلط واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
تنقية المنتج رد فعل كما هو موضح في بروتوكول النص وتخزين الناتج المنتج على الجليد أو في أربع درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام. للبدء، قم بإجراء فحص جودة على خلية التدفق قبل الاستخدام. وتحقيقا لهذه الغاية، قم بتوصيل جهاز التسلسل بالكمبيوتر المضيف وفتح البرنامج.
أدخل خلية تدفق في جهاز التسلسل. ثم اختر نوع خلية التدفق من مربع المحدد وانقر فوق المتوفر للتأكيد. في الجزء السفلي من الشاشة، انقر فوق التحقق من خلية تدفق واختيار نوع خلية التدفق الصحيح.
انقر فوق اختبار البدء لبدء فحص الجودة. ويلزم وجود ما لا يقل عن 800 من الجراثيم النانوية النشطة في المجموع لكي تكون خلية التدفق قابلة للاستخدام. أولاً، افتح غطاء المنفذ الأولي عن طريق تحريكه في اتجاه عقارب الساعة.
تعيين ماصة P1000 إلى 200 ميكروليترس وأدخل تلميح في ميناء فتيلة. ثم ضبط ماصة إلى 230 ميكروليترس مع الحفاظ على طرف في ميناء فتيلة لرسم ما يصل 20 إلى 30 ميكرولترات من العازلة وإزالة أي فقاعات الهواء. في جديد 1.5 ملليلتر الحمض النووي انخفاض تفاعل أنبوب ملزمة، وإعداد مزيج فتيلة من خلال الجمع بين 576 ميكرولترات من العازلة RBF مع 624 ميكرولترات من المياه الحرة النوى.
دقيق ماص 800 ميكرولترات من مزيج فتيلة أعدت في ميناء فتيلة والانتظار خمس دقائق. بعد هذا، رفع غطاء ميناء العينة والماصات إضافية 200 ميكرولترات من مزيج فتيلة أعدت في ميناء فتيلة. Pipette 35 ميكرولترات من المخزن المؤقت RBF في جديد نظيفة 1.5 ملليلتر الحمض النووي منخفضة ربط أنبوب التفاعل.
مزيج دقيق الخرز LLB عن طريق pipetting وإضافة 25.5 ميكرولترات من الخرز إلى المخزن المؤقت RBF. المقبل، إضافة 2.5 ميكرولترات من المياه الحرة النوى و 12 ميكرولترات من مكتبة الحمض النووي ومزيج عن طريق الأنابيب. إضافة 75 ميكرولترات من خليط عينة بطريقة بطيئة انخفاض الحكمة إلى خلية تدفق عبر منفذ العينة.
ثم استبدال غطاء منفذ العينة، إغلاق منفذ فتيلة وإغلاق غطاء جهاز التسلسل. ضمن البرنامج، تأكد من أن خلية التدفق لا تزال متاحة. افتح تجربة جديدة ثم قم بإعداد معلمات التشغيل عن طريق تحديد المجموعة المستخدمة.
حدد livecalling. ابدأ تشغيل التسلسل بالنقر فوق تجربة البدء. متابعة تشغيل التسلسل حتى يتم تجميع بيانات تجريبية كافية.
في تجربة تمثيلية، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من 10 عينات دم مختلفة من خمسة أنواع حيوانية. ويلاحظ تركيزات الحمض النووي الريبي بين 43 نانوغرام و543 نانوغرام لكل ميكرولتر. بعد التضخيم بواسطة RT-PCR، تحليل هلام من المنتجات PCR MPC1 يظهر نتائج مختلفة مع عصابات أضعف بشكل ملحوظ للعينات BC01 و BC02.
وهذه الاختلافات هي على الأرجح بسبب الاختلافات في نوعية العينة على الرغم من أن الاختلافات في فعالية PCR بسبب الاختلافات في التمهيدي ملزمة للجين MCP1 من الأنواع المختلفة لا يمكن استبعادها. غير أن هذه الاختلافات في كفاءة الغلة و/أو التضخيم لا تؤثر بشكل ملحوظ على نتائج التسلسل الإجمالية. مجموعة فرعية من 10,000 يتم الحصول على القراءة ثم يتم تحديد و demultiplexed لمزيد من التحليل.
من 10،000 يقرأ تحليلها، 5، 457 تظهر طول بين 1، 750 و 2، 000 النيوكليوتيدات التي تطابق الأحجام المتوقعة لشظايا PCR تضخيم كجزء من سير العمل لدينا. ويلاحظ ارتفاع إضافي في توزيع طول القراءات بين 250 و500 نوكليوتيدات يمكن أن تعزى إلى منتجات PCR غير محددة. يسمح ديمولتيبليكسينج من يقرأ التعيين من 87.6٪ من القراءة إلى واحدة من العينات 10 تحليلها.
في حين أن هذه الطريقة موثوق بها تماما، في ظل الظروف الميدانية، والتضخيم PCR هو الخطوة الأكثر إشكالية. خلال تجاربنا، كانت البروتوكولات المتداخلة ضرورية في كثير من الأحيان لتضخيم التسلسلات المستهدفة. إلى جانب تسلسل الجينات المضيف الحيوانية، يمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتسلسل أي الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي بما في ذلك مسببات الأمراض الفيروسية أو البكتيرية.
ولذلك فإن تسلسل النانوبور يستخدم الآن بشكل متزايد ليس فقط خلال تفشي الأمراض أو للدراسات العلمية في الأماكن النائية ولكن أيضا في المختبرات العادية حيث تفتح أطوال القراءة الطويلة إمكانيات بحث جديدة مثيرة. وفي حين أن أياً من الكواشف المستخدمة لا يتسم بالخطورة على نحو خاص، فإنه ينبغي اتباع الممارسات المختبرية الجيدة القياسية. من الواضح عند تسلسل عوامل المرض ، يجب مراعاة جميع الاحتياطات اللازمة للتعامل مع هذه العوامل.
