يمكن استخدام هذا البروتوكول المناعي الكيميائي والهيستوباثي لفحص مستقبلات الفولات بيتا ، وهو بروتين مرشح مع قيمة تنبؤية وعلاجية محتملة للبيئة الدقيقة الوعائية في التهاب الشرايين الخلية العملاقة. هذا البروتوكول هو اختبار الزمن وتستخدم على نطاق واسع، ويمكن استخدامها لاستكشاف سمات بيتا مستقبلات الفولات في أنسجة الشرايين الصدغية، حتى بعد التخزين على المدى الطويل. للحصول على أقسام الأنسجة، استخدم ميكروتوم لشريحة أربعة إلى خمسة أجزاء سميكة ميكرومتر من الشرايين الصدغية المضمروسة البارافين، تطفو كل قسم في حمام مائي 40 درجة مئوية كما يتم الحصول عليها، لإزالة التجاعيد.
استخدم شرائح المجهر الزجاجي لالتقاط ثلاثة أقسام لكل شريحة، ودفئ الشرائح على لوحة دافئة، في فرن درجة مئوية 60 لمدة 60 دقيقة. عندما تكون الأقسام قد التزمت بالشرائح، ضع الشرائح في رف عمودي للتجفيف عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، قم بنقل الشرائح إلى حاوية شرائح للتخزين عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل.
بعد ذلك، قم بتحميل الشرائح في رف الشريحة وترطيب الأنسجة مع اثنين من خمس دقائق، 100٪ الإكسيلين الغمر والهادر، خمس دقائق لكل تركيز سلسلة الغمر الإيثانول، مع 10 ثانية من الانفعالات كل 30 ثانية. بعد غمر الإيثانول بنسبة 70٪، شطف الشرائح مرتين في الماء المقطر مزدوجة لمدة خمس دقائق، مع 10 ثانية من الانفعالات كل 30 ثانية. لاسترجاع المستضد، قم بنقل الحامل إلى حاوية زجاجية مع 200 ميكرولترات من 95 درجة مئوية، 10 ملليمولار لكل لتر من عازلة سترات لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة، والسماح للشرائح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة قبل الشطف مع المياه الجارية لمدة خمس دقائق. لإزالة نشاط البيروكسيد العضوي ، استخدم أولاً علامة رهاب الماء لرسم دائرة حول كل عينة من الأنسجة ، قبل احتضان العينات في 200 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 10 دقائق ، تليها 3 يغسل في 200 micoliters من محلول ملحي ثلاثيات المخزن ، أو TBSS ، لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، داب كل شريحة بلطف لإزالة أي العازلة الزائدة وإضافة 200 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الأولية من الفائدة وزلة غطاء إلى كل شريحة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة، تخلص من زلات الغطاء وشطف الشرائح مع ثلاث يغسل لمدة دقيقتين في TBSS الطازجة. بعد إزالة العازلة الزائدة، إضافة 200 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية الحيوية المناسبة وزلة غطاء إلى كل شريحة لاحتضان لمدة 45 دقيقة في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة. بعد تجاهل زلات الغطاء، شطف الشرائح مع TBSS كما هو موضح.
إزالة أي المخزن المؤقت الزائد. وتسمية المقاطع مع 200 ميكرولترات من العازلة الركيزة DAB لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح مع TBSS والمياه الصنبور الجارية لمدة 10 دقائق، قبل أن تُلَمَّى مع الهماتروسيلين لمدة ثلاث دقائق.
ثم، إضافة 70 microliters من وسيلة مناسبة تصاعد لكل شريحة وببطء طرف شريط غطاء زجاجي على المتوسطة المتصاعدة لتجنب خلق فقاعات كما يتم خفض زلة الغطاء في مكانها. للتحليل الهستواثي، ضع الشريحة على خشبة المجهر الخفيف وقيّم هندسة الأوعية الدموية لقسم الأنسجة الأول. ثم، كمي عدد الضامة نسبة إلى عدد الخلايا الليمفاوية لكل قسم.
للتحليل المناعي الكيميائي، ودراسة مستقبلات حمض الفوليك نمط تلطيخ بيتا على كل قسم الأنسجة وتحديد عدد مستقبلات الفولات بيتا إيجابية، CD68 إيجابية، وD3 الخلايا الإيجابية في 10 حقول الطاقة العالية مختارة عشوائيا لكل قسم. Hematoxylin وeosin تلطيخ في العينات العادية يكشف عن تشريح الشرايين الطبيعية، مع الخلايا البطانية في التميمة تونيكا، والخلايا العضلية الملساء في وسائل الإعلام tunica، ومصفوفة الكولاجين غير متجانسة، التي تشمل الخلايا الليفية والأوعية المغذية تسمى vasorum vasa في tunica adventitia. الشرايين الدهنية الضبيّة الضّيّاقية الضّيّاقية الضّيّاقة الضّيِقّة الضّيِمّة تُظهر التهابًا متوسطًا إلى حادًا، مع المجاميع والضمّة، أو الهُسَقَيّة، الخلايا اللمفية، خلايا البلازما العرضية، وخلايا عملاقة متعدّد النوى.
ويلاحظ أيضا تضييق Luminal، ويرافقه سماكة إيمينال وتعطيل 90٪ من lamina مرنة الداخلية. CD3 اللمفاويات الإيجابية وD68 الضامة الإيجابية موجودة أيضا في جميع العينات التهاب الشرايين الخلية العملاقة إيجابية، مع أنماط تلطيخ مماثلة لوحظت في جميع الخزعات. يقتصر تلطيخ مستقبلات الفولات بيتا على الضامة والخلايا العملاقة متعددة النواة التي تُحل بشكل تفضيلي إلى المُلَوَة ووسائل الإعلام.
الجدير بالذكر، شملت مستقبلات الفولات بيتا ما يقرب من 30٪ من الضامة الإجمالية. تتطلب معالجة خزعة الشريان الزمني، والقطع، والديواكسين البراعة الدقيقة من أجل تنفيذ الخطوات اللاحقة. يتطلب تفسير الشريحة خبرة أخصائي أمراض القلب والأوعية الدموية من ذوي الخبرة.
ذكّر المشاهدين باستخدام التلامس والاحتياطات التنفسية، مثل القفازات والأغطية المهوّنة، عند التعامل مع العينات والكواشف.
