Este protocolo imunohistoquímico e histopatológico pode ser usado para examinar o receptor beta, que é uma proteína candidata com potencial valor prognóstico e terapêutico ao microambiente vascular em arterite celular gigante. Este protocolo é testado por tempo e amplamente empregado e pode ser usado para explorar os atributos beta do receptor de folato em tecidos da artéria temporal, mesmo após o armazenamento a longo prazo. Para adquirir seções de tecido, use um microtome para cortar de quatro a cinco micrômetros de seções de espessura de artérias temporais incorporadas à parafina, flutuando cada seção em um banho de água de 40 graus Celsius à medida que são obtidos, para remover rugas.
Use slides de microscópio de vidro para capturar três seções por slide, e aqueça os slides em uma placa de aquecimento, em um forno de 60 graus Celsius por 60 minutos. Quando as seções tiverem aderido aos slides, coloque os slides em um rack vertical para secar a 37 graus celsius por 24 horas. No dia seguinte, transfira os slides para um recipiente de slides para armazenamento a quatro graus Celsius por pelo menos 12 horas.
Em seguida, a carga desliza em um rack de slides e hidrata os tecidos com duas imersões de cinco minutos, 100% xileno e uma série de imersão de etanol descendente de cinco minutos por concentração, com 10 segundos de agitação a cada 30 segundos. Após a imersão de 70% de etanol, enxágue os slides duas vezes em água duplamente destilada por cinco minutos, com 10 segundos de agitação a cada 30 segundos. Para recuperação de antígeno, transfira o rack para um recipiente de vidro com 200 microliters de 95 graus Celsius, 10 mililitros por litro de tampão citrato por 30 minutos.
No final da incubação, deixe os slides esfriarem até a temperatura ambiente por 20 minutos antes de enxaguar com água corrente por cinco minutos. Para remover a atividade peroxidase endógena, primeiro use um marcador hidrofóbico para desenhar um círculo em torno de cada amostra de tecido, antes de incubar as amostras em 200 microliters de peróxido de hidrogênio de 3% por 10 minutos, seguido por 3 lavagens em 200 micoliters de solução salina tris-tamponada, ou TBSS, por lavagem. Após a última lavagem, debocoe cada slide suavemente para remover qualquer excesso de tampão e adicione 200 microliters do coquetel de anticorpos primário de interesse e um deslizamento de cobertura em cada slide para uma incubação de uma hora em uma câmara úmida à temperatura ambiente.
No final da incubação, descarte os deslizamentos de cobertura e enxágue os slides com três lavagens de dois minutos em TBSS frescos. Depois de remover o buffer em excesso, adicione 200 microliters de uma solução de anticorpos secundários biotiningadas apropriada e um deslizamento de cobertura para cada slide para uma incubação de 45 minutos na câmara úmida à temperatura ambiente. Depois de descartar os deslizamentos de cobertura, enxágue os slides com TBSS como demonstrado.
Remova qualquer excesso de buffer. E rotule as seções com 200 microliters de tampão de substrato DAB por 10 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação, lave os slides com TBSS e água da torneira por 10 minutos, antes de contra-atacar com hematoxilina por três minutos.
Em seguida, adicione 70 microliters de um meio de montagem apropriado a cada slide e lentamente coloque uma tampa de vidro no meio de montagem para evitar a criação de bolhas à medida que o deslizamento da tampa é abaixado no lugar. Para análise histopatológica, coloque o slide no estágio de um microscópio leve e avalie a arquitetura vascular da primeira seção tecidual. Em seguida, quantifique o número de macrófagos em relação ao número de linfócitos por seção.
Para análise imunohistoquímica, examine o padrão de coloração beta do receptor de folato em cada seção de tecido e quantifique o número de células beta positivas do receptor de folato, CD68 positivo e CD3 em 10 campos de alta potência selecionados aleatoriamente por seção. A coloração de hematoxilina e eosina em espécimes normais revela uma anatomia arterial normal, com células endoteliais na tunica intima, células musculares lisas na mídia tunica, e uma matriz de colágeno heterogênea, que incluem fibroblastos e vasos alimentador chamados vasa vasorum na tunica adventitia. Artérias temporais positivas da arterite celular gigante demonstram uma inflamação moderada a grave, com agregados e macrófagos, ou histiocitos, linfócitos, células plasmáticas ocasionais e células gigantes multi-nucleadas.
O estreitamento luminal também é notado, e acompanhado de espessamento intimal e uma interrupção de 90% da lâmina elástica interna. Linfócitos positivos CD3 e macrófagos positivos CD68 também estão presentes em todas as amostras positivas de arterite celular gigante, com padrões de coloração semelhantes observados em todas as biópsias. A coloração para o receptor de folato beta é restrita a macrófagos e células gigantes multi-nucleadas que preferencialmente localizam para a adventitia e mídia.
Notavelmente, o receptor beta do folato compreendeu aproximadamente 30% do total de macrófagos. A biópsia da artéria temporal processando, cortando e desapóxing requerem destreza cuidadosa para realizar etapas subsequentes. A interpretação do slide requer a experiência de um patologista cardiovascular experiente.
Lembre os espectadores a usar em contato e precauções respiratórias, como luvas e capuzes ventilados, ao manusear espécimes e os reagentes.
