Этот иммуногистохимический и гистопатологический протокол может быть использован для изучения бета-рецептора фолиевой кислоты, который является кандидатом белка с потенциальной прогностической и терапевтической ценностью для микроокноронирования сосудов при гигантском клеточном артериите. Этот протокол проверен временем и широко используется и может быть использован для изучения бета-атрибутов рецепторов фолиевой кислоты в тканях височной артерии, даже после длительного хранения. Чтобы приобрести секции тканей, используйте микротом, чтобы нарезать четыре-пять микрометров толщиной разделы парафин-встроенных височных артерий, плавающие каждый раздел в 40 градусов по Цельсию водяной бане, как они получены, чтобы удалить морщины.
Используйте стеклянные слайды микроскопа, чтобы захватить три секции на слайд, и тепло слайды на греющим пластины, в 60 градусов по Цельсию духовке в течение 60 минут. Когда секции прилипли к слайдам, поместите слайды в вертикальную стойку для сушки при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. На следующий день перенесите слайды в контейнер для хранения при четырех градусах по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов.
Затем нагрузка скользит в стойку слайда и увлажняет ткани двумя пятиминутными, 100%-ти ксилеными погружениями и нисходящей пятиминутной серией погружения этанола в концентрацию, с 10 секундами возбуждения каждые 30 секунд. После погружения 70%ethanol, промойте горки два раза в двойной дистиллированной воде в течение пяти минут, с 10 секундами возбуждения каждые 30 секунд. Для извлечения антигена перенесите стойку в стеклянный контейнер с 200 микролитров 95 градусов по Цельсию, 10 миллимолярной на литр цитрат буфера в течение 30 минут.
В конце инкубации, дайте слайдам остыть до комнатной температуры в течение 20 минут, прежде чем полоскания с проточной водой в течение пяти минут. Чтобы удалить эндогенную активность пероксидазы, сначала используйте гидрофобный маркер, чтобы нарисовать круг вокруг каждого образца ткани, прежде чем инкубировать образцы в 200 микролитров 3%перекиси водорода в течение 10 минут, а затем 3 моет в 200 миколитеров трис-буферного солевого раствора, или TBSS, за стирку. После последней стирки, мазок каждый слайд осторожно, чтобы удалить излишки буфера и добавить 200 микролитров первичного антитела коктейль интерес и крышка скольжения на каждый слайд в течение одного часа инкубации во влажной камере при комнатной температуре.
В конце инкубации отбросьте крышку скользит и промойте горки тремя двухминутными мойки в свежем TBSS. После удаления избыточного буфера добавьте 200 микролитров соответствующего биотинилированного вторичного раствора антител и крышку скольжения к каждому слайду для 45-минутной инкубации во влажной камере при комнатной температуре. После отбрасывания крышки скользит, промыть слайды с TBSS, как попродемонстрировано.
Удалите лишний буфер. И обозначить секции 200 микролитров буфера субстрата DAB в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации, мыть горки с TBSS и проточной водопроводной водой в течение 10 минут, прежде чем счетчики с гематоксилином в течение трех минут.
Затем добавьте 70 микролитров соответствующей крепления среды к каждому слайду и медленно наконечник стеклянной крышкой полосы на монтажную среду, чтобы избежать создания пузырьков, как крышка скольжения опускается на место. Для гистопатологического анализа поместите слайд на стадию светового микроскопа и оцените сосудистую архитектуру первой секции тканей. Затем количественно количество макрофагов по отношению к количеству лимфоцитов на секцию.
Для иммуногистохимического анализа изучите бета-окрашивание рецепторов фолата на каждом участке ткани и количественно оцените количество бета-позитива рецепторов фолата, CD68 положительных и CD3 положительных клеток в 10 случайно выбранных высокой мощности полей на секцию. Гематоксилин и эозин окрашивания в нормальных образцах показывает нормальную артериальную анатомию, с эндотелиальными клетками в индиме туники, гладкие мышечные клетки в средствах массовой информации туники, и неоднородной коллагеновой матрицы, которые включают фибробласты и фидеровые сосуды, называемые vasa vasorum в туника adventitia. Гигантский клеточный артерит положительные височные артерии демонстрируют умеренное и тяжелое воспаление, с агрегатами и макрофагами, или гистоциты, лимфоциты, случайные плазменные клетки, и многоядерные гигантские клетки.
Также отмечается сужение Luminal, сопровождаемое интимальным утолщением и 90%-ным нарушением внутренней эластичной ламины. CD3 положительные лимфоциты и CD68 положительные макрофаги также присутствуют во всех гигантских клеточных артериит положительных образцов, с аналогичными окрашивания моделей наблюдается во всех биопсий. Окрашивание бета-рецептора фолиевой кислоты ограничивается макрофагами и многоядерными гигантскими клетками, которые преимущественно локализуются для адвентитии и средств массовой информации.
Примечательно, что бета-версия рецепторов фолата составила около 30% от общего объема макрофагов. Обработка биопсии височной артерии, резка и роса требуют тщательной ловкости для того, чтобы выполнить последующие шаги. Слайд интерпретация требует опыта опытного сердечно-сосудистого патологоанатома.
Напомните зрителям использовать контактные и дыхательные меры предосторожности, такие как перчатки и вентилируемые капюшоны, при обращении с образцами и реагентами.
