يوفر هذا البروتوكول طريقة سريعة لتقييم آثار إسقاط جين WC5 ، وهو السبب الأكثر شيوعا للصرع البؤري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا استخدامها لتقييم الصرع ، مثل النمط الظاهري باستخدام كل من الميزات السلوكية والفسيولوجية في مراحل مختلفة من التطور. قبل يوم واحد من الحقن الدقيق، قم بإعداد خزانات التزاوج حمار وحشي.
في صباح يوم الحقن، قم بإزالة المقسمات لتمكين التفريخ. استخدام منخل غرامة لنقل البيض إلى أطباق بيتري 100 ملليمتر، مليئة بماء الجنين. باستخدام ماصة باستور بلاستيكية، اختر 60 إلى 80 بيضة، ورتب البيض في طبق بيتري المغلف بالسيليكون للحقن.
نحرك معظم الماء، تاركين ما يكفي لتغطية البيض في منتصف الطريق. ضع إبرة زجاجية عموديا في أنبوب من محلول الحقن. السماح للمحلول الملونة لملء أنبوب عن طريق العمل الشعرية على مدى فترة من عدة دقائق.
عندما يكون محلول الحقن مرئيا في طرف الإبرة ، قم بتركيب الإبرة على مقبض الحقن للحقن الدقيق ، ثم قم بتشغيل ضاغط الهواء. ضبط إعداد الضغط لتوليد اثنين من وحدة تخزين حقن نانولتر. ووضع البيض تحت المجهر المجهري تشريح، مع التكبير أربع مرات.
أدخل طرف الإبرة من خلال المشيمة وصفار أجنة المرحلة الواحدة لحقن المحلول مباشرة داخل كل خلية. ثم نقل الأجنة المحقونة في طبق بيتري 100 ملليمتر المسمى من ماء الجنين، ووضع لوحة في حاضنة 28 درجة مئوية. 28 ساعة بعد الإخصاب، ضع البلاستيك 1.2 في 1.2 ملليمتر شبكة شبكة في الجزء السفلي من طبق الاختبار.
استخدام ماصة باستور البلاستيك لوضع 10 إلى 12 الأجنة داخل المشيمات على شبكة بلاستيكية. ملء الطبق مع ما يكفي من مياه الجنين للحفاظ على الجنين المغمورة، ولكن ليس العائمة، تتحرك بعناية الأجنة مع طرف من البلاستيك في موقف على الشبكة حسب الضرورة. ثم، باستخدام كاميرا فيديو متصلة بمجهر تشريح، سجل نشاط اللف التلقائي لمدة 10 إلى 20 دقيقة.
لتحليل الحركة العفوية الكلية، استخدم وحدة القياس الكمي للنشاط في نظام مختبر Zebra لتحميل الفيديو المسجل وتصميم ساحات التتبع حول كل جنين حسب الاقتضاء. تعيين عتبات التجميد والإنفجار إلى 10 و 50 على التوالي. وعندما تحليل الفيديو الآلي، الذي يحدد كميا النشاط الإجمالي داخل كل من الساحات المحددة.
ثم استرداد مجموعة البيانات كجداول بيانات لإجراء التحليل، وذلك باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسبة. 46 ساعة بعد الإخصاب، واستخدام ملقط ناعم ل dechorionate الأجنة، وملء طبق اختبار 130 ملليمتر مع ماء الجنين. قبل 15 دقيقة على الأقل من البقية، قم بتدفئة طبق الاختبار في حاضنة 28 درجة مئوية.
لإجراء اختبار استجابة الهروب الذي أثارته اللمسة ، استخدم ماصة باستور بلاستيكية لوضع جنين في وسط طبق الاختبار ، تحت الكاميرا. ابدأ التسجيل باستخدام معدل اقتناء 30 إطارا في الثانية. باستخدام طرف بلاستيكي ناعم، المس ذيل الجنين قليلا بحركة نفض الغبار.
إيقاف التسجيل ، عندما تنهي اليرقة حركتها. ثم، نقل الجنين إلى طبق عقد جديد مملوءة بمياه الأجنة العذبة، وتكرار الاختبار مع أكبر عدد ممكن من الأجنة حسب الحاجة لكل حالة تجريبية. لإعداد سمكة الحمار الوحشي للتحليل الكهربي، ضع يوما أو أربعة إلى ستة أيام بعد الإخصاب في طبق بيتري ذو القاع الزجاجي.
إزالة أي فائض، متوسط بحار إضافي لضمان أن الأسماك ستكون أقرب إلى الجزء السفلي من الطبق ممكن. استخدم ماصة بلاستيك باستور لإضافة ما يكفي من الزراعة السائلة الدافئة لتغطية اليرقة. في حين أن هاردنيس agros، استخدم ملقط غرامة لتوجيه الجانب البطيني الأسماك إلى أسفل في وسط الطبق.
ثم أضف ملليلترين من محلول التسجيل ، الذي يحتوي على 10 بروميد بانكورونيوم ميكرومولار إلى الطبق لمنع انتقال العدوى العصبية والعضلية. بعد ذلك، ملء micropipetting مع تسجيل الحل، واستخدام مكبر للصوت المشبك التصحيح في تكوين المشبك الجهد، لقياس مقاومة القطب في الحمام لتأكيد قيمته الصحيحة. باستخدام هدف 20x ، ضع رأس اليرقة في مجال الرؤية المركزي ، وخفض micropipet للوصول إلى موضع التسجيل داخل استئصال البصري.
تبديل مكبر للصوت المشبك التصحيح إلى تكوين المشبك الحالي وإصلاح عقد الحالي إلى صفر مللي أمبير. باستخدام مرشح تمرير منخفض من كيلوهيرتز واحد، ومعدل الاستحواذ من كيلوهيرتز واحد، ومكاسب رقمية من 10، وتسجيل النشاط التلقائي للأسماك لمدة 60 دقيقة لتحديد مستويات النشاط الأساسي. في نهاية التسجيل الأساسي، في 143 ميكرولتر من 300 ملليمولار لكل لتر pentylenetetrazole حل للحمام، لتركيز النهائي من 20 ملليمولار للتر الواحد.
سجل النشاط العصبي للحيوان في محلول pentylenetetrazole لمدة 120 دقيقة أخرى. خلال الفترة الأساسية للتسجيل، أربعة إلى ستة أيام بعد الإخصاب نماذج الصرع سمك الحمار الوحشي تظهر حدوث أعلى من الأحداث العفوية، في حين أن عدم التطابق مراقبة الأسماك عرض تقلبات قليلة جدا. بعد تطبيق pentylenetetrazole، كل من السيطرة على عدم التطابق والنماذج الصرع حمار وحشي الأسماك المعرض عددا متزايدا من أحداث الاستقطاب العميق.
خلال الفترة الأولى بعد تطبيق pentylenetetrazole ، لوحظ معدل 0.8 حدث في الدقيقة في كل من التحكم في عدم التطابق وهدم الحيوانات التي تكون غالبية الأحداث ذات سعة عالية. خلال فترة الاستجابة الأخيرة. معدل أحداث إزالة الاستقطاب يزيد إلى حوالي حدث واحد في الدقيقة الواحدة.
وغالبية الأحداث ذات سعة منخفضة. عند تنفيذ هدم, من المهم جدا لتحديد الجرعة الصحيحة من مورفولينوس باستخدام منحنى استجابة الجرعة وتنفيذ الضوابط لتجنب سمية غير محددة. هذه الدفعة لتمكين العديد من الدراسات المصب، بما في ذلك اختبار آثار المعدلات الوراثية أو الكيميائية.
وسلوك حمار وحشي ونشاط الأنشطة العصبية لفهم الآثار التنموية للطفرات الخمس DC.
