هذا البروتوكول يجعل من الممكن لتقييم التعديلات المورفولوجية المحتملة في الخلايا العصبية والعمود الفقري التشعب التي قد تؤكد التشوهات الكيميائية العصبية والسلوكية. وهي فريدة ومفيدة لتصور الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة في الفئران، والتي في تركيبة مع برامج إعادة الإعمار المتطورة يسمح للباحثين لتوضيح الآليات الممكنة الكامنة وراء الخلل العصبي المعرفي. ابدأ بإعداد حل PVP وفقًا لتوجيهات المخطوطات.
ملء الأنابيب مع PVP وتركها لمدة 20 دقيقة. وطرده من خلال الطرف الآخر مع حقنة 10 ملليلتر. الجمع بين 170 ملليغرام من الخرز microcarrier التنغستن مع 250 ميكرولترات من كلوريد الميثيلين.
ثم دوامة تماما تعليق. بعد ذلك، إضافة 6 ملليغرام من ديلك 18 الدهني (3) صبغ إلى 300 ميكرولترات من كلوريد الميثيلين ودوامة. Pipet 250 ميكرولترات من تعليق حبة التنغستن على شريحة زجاجية.
انتظر تعليق للهواء الجاف وإضافة 300 ميكرولترات من محلول الصبغة. مرة واحدة المجففة، واستخدام شفرة حلاقة لتقسيم الخليط إلى اثنين من أنابيب الطرد المركزي 1.5 ملليلتر وملء الأنابيب بالماء. سونيكات الخليط في حمام مائي حتى متجانسة.
التأكد من أن تلميح sonicator تقع مباشرة على الأنابيب. الجمع بين خليط اثنين في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. و sonicate لمدة ثلاث دقائق أخرى، والتأكد من عدم وجود كتل كبيرة من الخرز المغلفة صبغ لا تزال.
بعد سونيكيشن، رسم الخليط في أنابيب PVP المغلفة مع حقنة 10 ملليلتر. وإطعام الأنابيب في محطة التحضير. تدوير الأنابيب لمدة دقيقة واحدة.
إزالة بعناية كل الماء باستخدام حقنة. بدوره على غاز النيتروجين وضبط تدفق النيتروجين إلى ما يقرب من 0.5 لتر في الدقيقة الواحدة. تدوير الأنابيب في محطة إعداد وتجفيفه مع النيتروجين لمدة 30 دقيقة.
إزالة أنابيب من المحطة وقطع إلى شرائح 13 ملليمتر مع قاطع الأنابيب. تأكد من أن الفئران ليست استجابة للمحفزات الضارة وردود الفعل غائبة. ثم تأمينه في موقف supine.
إجراء شق على طول خط الوسط الصدري. فصل الحجاب الحاجز وفتح الصدر مع مقص. ثم أدخل إبرة قياس 20 25 ملليمتر في البطين الأيسر.
قطع فورا الأذين الأيمن مع مقص و perfuse 15 ملليلتر من 100 PBS ميليمولار مع 5 ملليمترات في الدقيقة معدل التدفق. ثم 100 milliliters perfuse من 4 ٪ PFA المخزنة في برنامج تلفزيوني. بعد التسريب، وإزالة الدماغ الفئران بأكملها.
و postfix مع 4 ٪ PFA لمدة 10 دقائق. استخدام مصفوفة الدماغ الفئران لقطع 500 ميكرومتر سميكة قسم التاجية. جعل قطع قبضة والحفاظ على شفرة في مكانها.
ثم جعل قطع الثانية مع شفرة الثانية وإزالة عموديا شفرة الأولى، والحفاظ على الأنسجة على سطح النصل. ضع شرائح الدماغ في لوحة 24-well مع 1 ملليلتر من PBS في كل بئر. وكرر العملية حتى يتم قطع جميع الشرائح.
إزالة برنامج تلفزيوني من كل المستهدفة بشكل جيد. تحميل الغضروف مع قطعة من ديل / التنغستن الأنابيب ووضعها في قضيب. وضع قطعة من ورقة التصفية بين شاشتي شبكة.
وربط قضيب خرطوم الهيليوم. ثم ضبط ضغط الناتج من الهليوم إلى 90 جنيه لكل بوصة مربعة. ضع قضيب عموديا على مركز المستهدفة جيدا 1.5 سم بين العينة وشاشة شبكة.
ثم اطلاق النار ديل / التنغستن الأنابيب. تحميل الغضروف مع الأنابيب المقبل وطلق النار باستمرار الخرز من الأنابيب على الشرائح المتبقية. ملء لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني 100 ميليمولار.
وغسل شرائح ثلاث مرات مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد. التأكد من أن الشرائح لا الوجه خلال الغسيل. عند الانتهاء، إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد إلى شرائح.
واحتضانهم لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية في الظلام. بعد الحضانة، استخدم فرشاة دقيقة لنقل شرائح الدماغ على الشرائح الزجاجية. وعلى الفور إضافة ملليلتر واحد من antifade تصاعد المتوسطة لكل قسم.
ضع غطاءً من 22 في 15 ملليمتر على الأقسام وجفف الشرائح في الظلام. قم بتشغيل نظام المجهر confocal والتحول إلى هدف 60X. ضبط إعدادات التصوير وفقًا لاتجاهات المخطوطة.
والحصول على صور Z-المكدس لنوع الخلايا العصبية المستهدفة على أساس حدود منطقة الدماغ والخصائص المورفولوجية للخلايا العصبية. عزل الخلايا العصبية القشرية الأولية من الفئران F344/N في اليوم التالي للولادة واحد وثقافتها في طبق أسفل الزجاج 35 ملليمتر لمدة أسبوع واحد. تحديث نصف الوسط في اليوم الثالث بعد العزل.
غسل الطبق مرتين مع 1 ملليلتر من 100 ملليمولار PBS. وأصلح الخلايا بنسبة 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تسمية الباليستية الخلايا كما هو موضح سابقا.
واغسلها ثلاث مرات مع 1 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى الخلايا واحتضانها لمدة ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية في الظلام. ثم إضافة 200 ميكرولترات من antifade تصاعد المتوسطة.
والحصول على صور Z-المكدس لكل الخلايا العصبية المستهدفة. تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية النموذجية في منطقة فرس النهر في أقسام دماغ الفئران مع تقنية وضع العلامات الباليستية التي تتميز بـ dendrite كبير و عدة dendrites القاعدية الأصغر حول سوما. تم استخدام برامج التحليل الكمي لإعادة بناء الخلايا العصبية لتتبع الفروع التشعبية والكشف عن العمود الفقري.
وفي وقت لاحق، تم استخدام البرنامج لتقييم تعقيد التفريع المتفرع وتعقيد العبور العصبي. تم تقييم التغيرات المورفولوجية في العمود الفقري التشعبي باستخدام الطول والحجم وقطر الرأس. ثم تم تصنيف العمود الفقري إلى العمود الفقري رقيقة، كعب، والفطر.
وفحص التردد النسبي لعدد من العمود الفقري بين كل دائرة نصف قطرها. مزيد من أكثر تم التحقق من صحة تقنية وضع العلامات الباليستية على الخلايا العصبية الهرمية الأولية في ثقافة الخلية. تم تحديد الخلايا العصبية الهرمية على أساس شكل مثلث سوما ودندريت apical كبيرة.
ثم تم استخدام برامج إعادة بناء الخلايا العصبية لتحليل توزيع العمود الفقري التشعب رقيقة وطول العمود الفقري التشعب. عند محاولة هذا البروتوكول، من المهم تجنب كتل كبيرة أو مجموعات من حبات التنغستن المغلفة بالمقذوفات من الطلاء بدءا من التحضير. الكتل لن تسمح بتمييز الخلايا العصبية الفردية.
جنبا إلى جنب مع برامج إعادة بناء الخلايا العصبية هذه الطريقة يسمح لنا لفحص مورفولوجيا العمود الفقري العصبي والتشعب في الخلايا العصبية الهرمية فرسان. برامج إعادة بناء الخلايا العصبية استخدام خوارزمية لتقديم تلقائيا بمساعدة تصنيف العمود الفقري التشعب. يوفر التحديد الكمي للمعلمات العصبية المتعددة فرصة لفهم أفضل للآلية الكامنة في الخلل المعرفي العصبي.
