يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة وقابلة للاستنساخ للحث على إصابة دماغية مؤلمة قابلة للتطوير في قوة حادة في سمك الحمار الوحشي البالغ. الحمار الوحشي الكبار التي تخضع لهذه القوة الحادة إصابات الدماغ الرضية تظهر العديد من الخصائص التي لوحظت في البشر التي تعاني من قوة حادة TBI. إثبات الإجراء سيكون السيد جيمس هينتيج والسيدة كيلي كلوغيسي، وهما طالبان دكتوراه من مختبري.
تبدأ بملء طبق بيتري مع الطين النمذجة. ثم استخدم الأصابع أو الجزء الخلفي من زوج من ملقط لإنشاء منصة مرتفعة مع الطين النمذجة إضافية. تقسيم المنصة التي أثيرت بالطول إلى نصفين متساوية تقريبا باستخدام شفرة حلاقة.
شكل النصفين في قناة، بحيث يستوعب طول سمكة الكبار. استخدام الطين إضافية لبناء الجدران لتأمين 2/3 من جسم السمك مع الرأس يتعرض. العفن دعم صغير في منطقة الرأس المكشوفة عمودي على الجدران لتجنب دوران أو ارتداد الرأس عند الإصابة.
تأكد من أن جوانب القناة لا تعيق الوزن المسقط. استخدم ثقبا صغيرا لإنشاء قرص فولاذي عيار 3 ملليمترات من وميض فولاذي عيار 22. ضع سمكة مخدرة لا تستجيب لقرصة الذيل على قالب الطين داخل القناة مع جانبها الظهري حتى يتم تأمين جسمها على الجانبين.
ضع القرص الفولاذي عيار 3 ملليمترات عيار 22 على الرأس، وتركز على نقطة الارتطام المطلوبة. محاذاة الأسماك عموديا لتجنب رأسها من إمالة إلى جانب واحد، والتي يمكن أن تسبب تأثير متفاوت. استخدام موقف حلقة القياسية ومشبك الذراع لتأمين أنابيب الصلب أو البلاستيك، وضمان أنها على التوالي، وبالتالي فإن الجزء السفلي من الأنابيب هو 1.5 سم فوق رأس حمار وحشي.
ننظر إلى أسفل الأنابيب لضمان محاذاتها فوق لوحة الصلب. اختيار الكرة المناسبة تحمل على أساس الشدة المطلوبة من الاصابة. إسقاط الكرة تحمل من ارتفاع محدد سلفا أسفل الأنابيب على لوحة الصلب.
ثم ضع الأسماك المصابة في خزان الإنعاش ليتم رصدها. ملء طبق بيتري مع الطين النمذجة وخلق تجويف صغير لدعم الجسم أثناء تشريح. وضع السمك في قالب الطين مع الجانب الظهري حتى.
ضع دبابيس تشريح اثنين ، واحدة من خلال خط الوسط في منتصف الطريق إلى أسفل الجسم والآخر حوالي 5 ملليمترات خلف قاعدة الرأس. استخدام زوج من 5 ملقط دومون لقطع العصب البصري بصراحة وإزالة العينين. ضع نهاية واحدة من ملقط 5 تحت لوحة الجدار الأيمن.
جعل عمل مقص المتعمد تتحرك نحو نهاية rostral وإزالة لوحة أمامية الحق. ثم تدوير الأسماك 90 درجة في اتجاه عقارب الساعة. ضع نهاية واحدة من ملقط 5 تحت لوحة الجدار الأيسر واستخدام نفس الحركة مقص لإزالة لوحات الجدار الأيسر والجبهي، وفضح الجانب الظهري بأكمله من الدماغ.
استخدام ملقط 5 لtransect بصراحة maxilla بحيث يتم الحفاظ على المصابيح الشمية وليس معطوبا. باستخدام نفس ملقط، وإزالة أوبركل الحق، قبل التكسير، interopercle، وشبه subopercle. ثم استئصال العضلات بصراحة في نهاية caudal من الجلجلة لفضح الحبل الشوكي.
باستخدام ملقط، بصراحة تحويل الحبل الشوكي. ضع ملقط بعناية تحت الدماغ وإزالة الدماغ بلطف من الجلجلة. تشريح الدماغ كله أو المنطقة ذات الاهتمام باستخدام التعليمات الواردة في المخطوطة النصية، ووضع الدماغ على الفور على قارب وزن صغير باستخدام ملقط ناعم، مع الحرص على عدم طعن أو كشط الدماغ.
نقل الدماغ إلى قارب وزن التجفيف القطران وتسجيل الوزن الرطب للدماغ. توجيه العقول لوضعها شقة على قارب الوزن مع الجانب الظهري التي تواجه. ثم ضع الدماغ والتجفيف وزن القارب في فرن التهجين تعيين إلى 60 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات.
لنقل الدماغ إلى قارب وزن صغير جديد ملطخ بمجرد جفافه ، قم بقرص ملقط ناعم معا ، وبدءا من الجانب البطني من الدماغ ، اغرف في حركة تصاعدية. إجراء شق جزئي على اسفنجة مبللة. ضع سمكة واحدة في كل مرة في الفتحة مع الجانب البطني لأعلى واستخدم إبرة قياس 30 لحقن ما يقرب من 40 ميكرولتر من 10 ملليمولار EdU في جسم السمكة.
ثم العودة الأسماك إلى خزان عقد مليئة مياه النظام. جمع العقول كما ذكر سابقا، ووضعها كمجموعة في قارورة زجاجية 9 ملليلتر تحتوي على 2 ملليلتر من تسعة أجزاء 100٪ الإيثانول إلى جزء واحد 37٪ الفورمالديهايد. إصلاح العقول في 4 درجات مئوية على منصة الروك.
استخدام تشاك cryostat لتضمين العقول في TFM في الاتجاه المطلوب على الجليد الجاف. تم العثور على إصابة الأوعية الدموية لتكون واحدة من أسهل وأبرز الأمراض لتحديد الإصابة الناجحة من خلال هذا النموذج. تغيرت القدرة على تحديد المؤشر مع سلالة الأسماك المستخدمة أثناء الإصابة.
كان من الصعب التمييز بين تحديد إصابات الأوعية الدموية في النوع البري AB بين TBI خفيفة أو معتدلة وأسماك التحكم غير التالفة بسبب التصبغ. بعد الإصابة، أظهرت أسماك TBI الخفيفة سحجات سطحية ضئيلة، في حين أظهرت أسماك TBI المعتدلة نزيفا دماغيا محدودا. وكان مدى الإصابة واضحا في أسماك TBI الشديدة.
في المقابل، يمكن التعرف على إصابة الأوعية الدموية بسهولة عند استخدام سمك المهق أو كاسبر. تم تقييم تورم في المخ بسبب الإصابة باستخدام وذمة. وعلى النقيض من ذلك، كان لكل من TBI المعتدل و TBI الشديد وذمة كبيرة، 1 نقطة في البوصة و 3 نقطة في البوصة، ولكن محتوى السوائل من كل من TBI المعتدل و TBI الشديد عاد إلى مستويات تشبه الضوابط غير التالفة بمقدار 5 نقطة في البوصة.
أدت هذه الإصابة القوة الحادة في استجابة قوية لانتشار الخلايا التي تمتد العصبية. ولوحظت زيادة وضع العلامات على وحدة التنفيس في المناطق البطينية وشبه البطينية في الدماغ الأمامي مقارنة بالضوابط غير التالفة. أظهرت الأدمغة المصابة زيادة وضع العلامات على EdU في المنطقة الرمادية المحيطة بالبطين ، والفص التكتل البصري ، وجوانب من تحت المهاد الأمامي مقارنة بأدمغة الأسماك غير التالفة.
بعد TBI الشديدة، أظهرت المناطق العصبية في الدماغ الخلفي زيادة انتشار الخلايا بالمقارنة مع الدماغ غير التالفة. للتحريض السليم للإصابة، تأكد من تأمين الأسماك ومستقرة في القالب، وأن الأنابيب مباشرة لتجنب تأثير خارج المركز أو تغيير مسار انخفاض الوزن. يوفر هذا الإجراء طريقة تحريضية سريعة وفعالة من حيث التكلفة لإصابة القوة الحادة تطبق على نموذج تجديدي ينطبق بشكل خاص على صدمة الرأس المتكررة أو الدراسات التجديدية الناجمة عن الإصابة.
