يوفر هذا البروتوكول نظامًا غير مكلف وقابل للتكيف لتقييم الديناميكيات الزمنية للإشارات الفلورية على Colletotrichum fiorniae وغيرها من مسببات الأمراض النباتية التي تصيب مصطلح ازهر. تمكن أجهزة جمع مياه الأمطار الجديدة المستخدم من مراقبة المنشطات والظروف الطبيعية التي تؤثر على تطور العوامل المسببة للأمراض بطريقة موقع محددة في الوقت الحقيقي تقريبًا. ابدأ هذا الإجراء مع ثقافة فيورنيا كوليتوتريشوم من مضيف مصاب بشكل طبيعي كما هو موضح في بروتوكول النص.
عندما تبدأ المستعمرات في sporulate، conidia خط على آخر V 8 عصير أجار تحتوي على طبق ثقافة الخلية لإنتاج ثقافة sporulating عالية الكثافة. بعد سبعة أيام من النمو، واستخدام حلقة معقمة القياسية لجمع كمية صغيرة من conidia من ثقافة عالية الكثافة عن طريق لمس طفيفة حلقة إلى كتلة مخروطية. حرك هذا في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من المياه المعقمة الأيونية.
دوامة هذه العينة لمدة 10 ثوان. باستخدام ماصة قياسية، يغرق صعودا وهبوطا عدة مرات لمزيد من خلط العينة. ثم ضع قطرة من عينة الدوامة على قياس الهيموسيتات المقدرة تركيزات البوغ.
ضبط تركيز إلى 0.1 مليون conidia لكل ملليلتر من الماء المقطر العقيمة مع حجم النهائي خمسة ملليلتر. ويشار إلى هذا باسم تعليق بوغ ويتم فقط مباشرة قبل استخدامها في أي بيوراسا. لتنفيذ استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم، تنظيف جميع المكونات مع 95٪ الإيثانول مرتين.
ثم تنظيف المكونات مرتين مع الكلوروفورم لمنع التلوث لكل استخراج. لا تقم بتنظيف أغطية PTFE المصطفة بالكلوروفورم لأنها ستلحق الضرر بهم. بعد التنظيف، وضع المكونات جانبا لتجف رأسا على عقب.
الجمع بين جزء واحد معالجة الزهور إلى تسعة أجزاء الكلوروفورم في منقار بإضافة الزهور ثم الكلوروفورم. دوامة بلطف لمدة 30 ثانية وسلالة من خلال شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ في beaker الثاني. صب استخراج القائمة على الكلوروفورم من الكأس الثاني في أنبوب الثقافة الزجاجية ولصق غطاء PTFE.
لف الغطاء مع parafilm لمنع التبخر. تخزين الناتجة استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم في الظلام للحد من تدهور الضوء في أربع درجات مئوية حتى الاستخدام التجريبي. كرر عمليات الاستخراج مع عدة عينات لتوفير النسخ المتماثلة.
لإنشاء جهاز تجميع لكل موقع محدد، استخدم بت خطوة متصل بمعصرة الحفر لحفر ثقب في الجزء السفلي من كوب الرش. ثم قطع خط مستقيم من أعلى الحفرة إلى فم كوب رذاذ. الآن حفر أربعة ثقوب متساوية البعد كبيرة بما يكفي لخيط الأسلاك المغلفة البلاستيكية في فم كوب رذاذ.
نعلق على نهاية واحدة من الأسلاك المغلفة البلاستيكية ترك نهاية واحدة مجانا. حفر حفرة كبيرة بما يكفي لخيط رذاذ الطلاء أو محول كوب في غطاء غطاء الطرد المركزي 50 ملليلتر. ختم خيوط محول مع parafilm لمنع تسرب.
إرفاق هذا إلى كل من غطاء الطرد المركزي وجزء مترابطة من كوب بخاخ. ثم نعلق تزاوج 50 ملليمتر الطرد المركزي أنبوب. إنشاء أربعة أجهزة جمع لكل موقع أخذ العينات.
نشر الأجهزة في مواقع مختارة عن طريق ثني أكواب البخاخ لتناسب على ينبع. توجيه الجانب قطع من كوب بخاخ صعودا باستخدام الأسلاك المغلفة البلاستيكية تعلق على ينبع الأخرى. وهذا يضمن أن يتم التقاط المياه التي تمر فوق الزهور.
لجمع مياه الأمطار من زهور التوت البري، ثقب الحرارة الأولى ثمانية ثقوب متساوية البعد حول مصب القمع باستخدام مسبار معدني. إدراج العلاقات تويست في أربعة من الثقوب. إرفاق الأطراف الأخرى إلى الموقع المقابل لتلك الحفرة تشكيل نمط عبور أنيق.
التفاف القمع أسفل البخار مع parafilm وتوضع جانبا. حفر حفرة كبيرة بما يكفي لإدراج جذع القمع إلى أسفل في قبعة جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر مع بت خطوة. أدخل القمع المعد في غطاء جهاز الطرد المركزي.
بعد هطول الأمطار أو الري العلوي، وإزالة واستبدال الجزء أنبوب أسفل أنبوب الطرد المركزي. ينبغي تغيير أنابيب جمع مياه الأمطار بسرعة بعد أحداث التبول لأنها عرضة للتدهور من الملوثات الطبيعية المعبأة في الجريان السطحي مثل البكتيريا والفطريات الأخرى. ضع طبقتين من الأقراص الورقية داخل أطباق الثقافة ونقع مع ميليلترين من الماء المقطر العقيم.
بعد ذلك، اخلطي كميات متساوية من الماء المقطر المعقم ومستخلصات الأزهار القائمة على الماء في أنبوبين ميكروسنتر ميليلتر. ثم إضافة حجم متساو من تعليق بوغ إلى إعداد اثنين من المليلتر microcentrifuge الأنابيب. ويشار إلى التحضير الناتج عن ذلك على أنه خليط معالجة مائي.
للسيطرة، حذف جزء استخراج الأزهار واستبدالها مع الماء المقطر العقيمة للحفاظ على تركيزات مخروطية متسقة. الآن ضع غطاء الزجاج المنظف مسبقًا على رأس المناشف الورقية الغارقة داخل طبق ثقافة الخلية. ضع 40 ميكرولتر من خليط العلاج مائي على مركز غطاء.
كرر هذا للعلاجات المطلوبة بما في ذلك التحكم. ثم أغلق طبق ثقافة الخلية. مرة واحدة وقد تم الاستغناء عن جميع العلاجات والمستنسخات، ووضع جميع أطباق ثقافة الخلية المنسوخة في وعاء من البلاستيك مختومة واحتضان في 25 درجة مئوية في الظلام.
في نقاط زمنية محددة مسبقًا، أضف 10 ميكرولترات من مثبت إلى القطرات التي توقف النمو وشبه الحفاظ على الجبل. مرة واحدة وقد تم إضافة المثبت، عكس بعناية الأغطية وضع كل واحد منهم الجانب قطرات أسفل على شريحة المجهر الزجاجي لتسهيل الفحص المجهري. عندما تكون جميع الأغطية على شرائح المجهر الزجاجي، اتركها لتسوية وتجف جزئيا في غطاء محرك التدفق لمدة 20 دقيقة.
عد جميع conidia الحاضر على الأغطية بما في ذلك conidia الأولية، conidia المنبتة، وكونيديا الثانوية شكلت حديثا، فضلا عن appressoria. العمل إما في 400 مرة التكبير أو 200 مرة مجموع مساحة 3.808 ملليمتر مربع. في غطاء محرك تدفق لامينر، إضافة اثنين من وحدات التخزين متساوية من الماء المقطر العقيمة وحجم واحد من تعليق بوغ إلى أنبوب ميكروسنتريفوج ملليلتر اثنين.
تعيين هذا خليط العلاج مائي جانبا لاستخراج الكلوروفورم الأزهار المستخرج bioassays. في غطاء أبخرة، ضع خلية فان تي على غطاء زجاجي داخل طبق ثقافة الخلايا البلاستيكية المعدة. الاستغناء عن 33 ميكرولترات من مستخلص الأزهار التي تعتمد على الكلوروفورم المطلوب في وسط الخلية والسماح لتجف.
لا تلمس جدران الخلية. لعلاج التحكم، إضافة الكلوروفورم البكر. مرة واحدة وقد جفت استخراج الأزهار القائمة على الكلوروفورم، الاستغناء 99 ميكرولترات من خليط المعالجة مائي المعدة مع ماصة قياسية في وسط الخلية فان T.
ثم أغلق جميع أطباق ثقافة الخلية واحتضانها. في نقاط زمنية محددة مسبقًا ، أضف 15 ميكرولترات من المثبت إلى Cell Van T واتركها تجلس لمدة خمس دقائق على الأقل لضمان التلطين الفطري الكافي. بعد ذلك الوقت، قم بإزالة خلية فان تي بعناية.
تنفيذ خطوات انعكاس الأغطية و الحصول على البيانات كما كان من قبل. عند التقييم المجهري لـ C.fiorniae في 24 ساعة بعد التطعيم ، فإن مقارنة conidia في وجود الماء المقطر العقيم مقابل مستخلص الأزهار القائم على الماء يكشف عن زيادة كبيرة في التصبغ الثانوي وتشكيل appressorium. غير أن التجليات الثانوية لم تكن واضحة عند مقارنة النماذج البيولوجية الكلوروفورم المعقمة في التحكم في المياه المقطرة بالمقتطفات القائمة على الكلوروفورم.
بدلا من ذلك، تحول نمو C.fiorniae نحو تشكيل appressorial. في هذا الفحص، تم فحص عملية معقم للتحكم في المياه المقطرة واستخراج الأزهار القائمة على التوت البري بشكل مرئي في حالة تلقيح بعد الساعة صفر وستة و12 و24 ساعة. بدأ تكوين Appressorium في ست ساعات في مستخلص الأزهار القائم على الكلوروفورم وازداد باطراد في جميع النقاط الزمنية اللاحقة.
وتدعم هذه النتيجة النتيجة التي تفيد بأن الزهور تقلل من الوقت اللازم لتشكيل هياكل العدوى. إدارة المرض للفطريات المتعفنة الفاكهة غالبا ما ينطوي على تطبيقات مبيد الفطريات تزهر الوقت. هنا، تم تقييم مقتطفات كلوروفورم التوت البري القائم على التوت البري من مراحل نمو متعددة من التوت البري بصرياً من أجل شمع السطح الفعال على C.fiorniae في 24 ساعة بعد التطعيم.
تم جمع المبيضين في يونيو، والفواكه غير الناضجة التي تم جمعها في يوليو، وفي أغسطس، تم جمع فاكهة محصّرة في أكتوبر، وتم فحص مراقبة المياه المقطرة المعقمة لتكوين appressorial. وكان المبيض المستخلصات القائمة على الكلوروفورم أكبر قدر من تكوين appressorial مما يدل على أهمية ازهر في دورة حياة C.fiorniae. العامل الممرض هو أهم مكون في هذا البروتوكول.
يجب نقل الفطريات إلى وسائل الإعلام الجديدة بشكل روتيني للحفاظ على الاتساق بين التجارب. يجب أن يتم تنفيذ أي عمل مع الكلوروفورم في غطاء أبخرة لأسباب تتعلق بالسلامة. ويشمل ذلك إعداد المواد والأواني الزجاجية، وإجراءات الاستخراج، وانسداد المعطيات البيولوجية القائمة على الكلوروفورم.
ويمكن استخدام مجموعات من النقاط الزمنية، أو مسببات الأمراض، أو مجموعات مياه الأمطار الأزهار، أو عمليات الاستخراج المضيفة لتقييم مختلف التفاعلات بين المضيفين والعوامل الممرضة. وستمكن أجهزة جمع مياه الأمطار والظواهر البيولوجية المرتبطة بها الآخرين من العمل مع المنشطات المضيفة التي تم تعبئتها خلال أحداث الأمطار في العديد من أنظمة المسارات.
