Этот протокол обеспечивает недорогую и адаптируемую систему для оценки временной динамики фторхимических сигналов на Colletotrichum fiorniae и других патогенных микроорганизмов растений, которые заражают термин цветения. Новые устройства сбора дождевой воды пола позволяют пользователю контролировать природные стимуляторы и условия, влияющие на развитие патогенов в почти реальном времени сайт-специфическим образом. Начните эту процедуру с культуры Colletotrichum fiorniae от естественно инфицированного хозяина, как описано в текстовом протоколе.
Когда колонии начинают sporulate, полоса conidia на другой V 8 Сок агар, содержащий клеточной культуры блюдо для производства высокой плотности sporulating культуры. После семи дней роста используйте стандартную стерильную петлю, чтобы собрать небольшое количество конидии из культуры высокой плотности, слегка касаясь петли к конидиальной массе. Перемешайте это в 15 миллилитровую центрифугу, содержащую 10 миллилитров стерильной деионизированной воды.
Вихрь этот образец в течение 10 секунд. Используя стандартную пипетку, окунитесь вверх и вниз много раз, чтобы еще больше смешать образец. Затем поместите каплю вихревого образца на гемоцитометр и оцените концентрацию спор.
Отрегулируйте концентрацию до 0,1 миллиона конидии на миллилитр стерильной дистиллированной воды с пятимиллилитровым окончательным объемом. Это называется споры подвески и производится только непосредственно перед использованием в любом bioassay. Для выполнения хлороформной цветочной экстракции очистите все компоненты 95%этанолом дважды.
Затем очистите компоненты дважды хлороформом, чтобы предотвратить загрязнение для каждой добычи. Не очищайте PTFE выстроились шапки с хлороформом, как это повредит их. После очистки отложите компоненты в сторону, чтобы высохнуть вверх дном.
Комбинат одной части обработанных цветов до девяти частей хлороформа в стакан, добавив цветы, а затем хлороформ. Аккуратно вихрем в течение 30 секунд и процедить через экран из нержавеющей стали во второй стакан. Налейте экстракт на основе хлороформа из второго стакана в стеклянную трубку культуры и прикрепите крышку PTFE.
Оберните крышку парафильмом, чтобы предотвратить испарение. Храните полученный цветочный экстракт на основе хлороформа в темноте, чтобы уменьшить деградацию света при четырех градусах Цельсия до экспериментального использования. Повторите извлечения с несколькими образцами для обеспечения репликаций.
Чтобы создать коллекционое устройство для каждого выбранного местоположения, используйте бит шага, прикрепленный к буровому прессу, чтобы просверлить отверстие в нижней части чашки спрея. Затем вырезать прямую линию от верхней части отверстия в рот спрей чашку. Теперь просверлите четыре равносторонних отверстия достаточно большой, чтобы нить пластиковой проволоки покрытием в устье спрей чашки.
Прикрепите один конец пластиковых проводов с покрытием, оставляя один конец свободным. Просверлите отверстие достаточно большой, чтобы нить краска спрей или чашки адаптер в 50 миллилитров центрифуги крышка крышкой. Печать адаптера потоков с парафильмом, чтобы предотвратить утечку.
Прикрепите это как к крышке центрифуги, так и к резьбовой части чашки опрыскиватель. Затем прикрепите 50-миллиметровую центрифугу. Создайте четыре устройства сбора данных на место выборки.
Развертывание устройств в выбранных местах путем сгибания распылителя чашки, чтобы поместиться на стебли. Ориентируйте разрезанную сторону чашки распылитель вверх, используя пластиковые провода с покрытием, прикрепленные к другим стеблям. Это гарантирует, что вода, проходящая над цветами, будет захвачена.
Для сбора дождевой воды из клюквенные цветы, первый тепловой прокол восемь равноустойных отверстий вокруг устья воронки с помощью металлического зонда. Вставьте твист связей в четыре отверстия. Прикрепите другие концы к противоположному расположению этого отверстия, образуя аккуратный рисунок пересечения.
Оберните воронку вниз парафильма и отложите в сторону. Просверлите отверстие достаточно большое, чтобы вставить воронку вниз стебель в 50 миллилитровую крышку центрифуги с шагом бит. Вставьте подготовленную воронку в крышку центрифуги.
После осадков или накладных орошения, удалить и заменить нижнюю часть трубки центрифуги трубки. Трубы сбора дождевой воды должны быть быстро изменены после смачивания событий, поскольку они склонны к деградации от природных загрязняющих веществ, мобилизованных в стоке, таких как бактерии и другие грибки. Поместите два слоя бумажных дисков в блюда культуры и замочите двумя миллилитров стерильной дистиллированной воды.
Затем смешайте равные объемы стерильной дистиллированной воды и цветочный экстракт на водной основе в двух миллилитровых микроцентрифугных трубках. Затем добавьте равный объем подвески споры в подготовленные двухми миллилитровые микроцентрифуговые трубки. Полученный препарат называют аквозной смесью для лечения.
Для контроля, опустить цветочный экстракт часть и заменить стерильной дистиллированной воды, чтобы сохранить конидиальные концентрации последовательной. Теперь поместите предварительно очищенные стеклянные крышки поверх пропитанных бумажных полотенец в клеточной культуре блюдо. Поместите 40 микролитровую каплю акной смеси лечения на центр крышки.
Повторите это для желаемого лечения, включая контроль. Затем закройте блюдо клеточной культуры. После того, как все процедуры и репликации были обойтись, поместите все реплицированные блюда клеточной культуры в запечатанный пластиковый контейнер и инкубировать при 25 градусов по Цельсию в темноте.
В заранее определенные точки времени добавьте 10 микролитров фиксатора к каплям, останавливающих рост и полу-сохраняющих гору. После того, как фиксатор был добавлен, тщательно инвертировать coverslips размещения каждого из них капли стороне вниз на слайде стеклянный микроскоп для облегчения микроскопического исследования. Когда все крышки находятся на стеклянных слайдах микроскопа, оставьте их урегулировать и частично высохнуть в потоке капота в течение 20 минут.
Подсчитайте все конидии, присутствующие на обложке, включая первичную конидию, проросли конидию и недавно сформированную вторичную конидию, а также аппрессорию. Работа либо в 400 раз больше, либо в 200 раз общей площадью 3,808 квадратных миллиметра. В капоте ламинарного потока добавьте два равных тома стерильной дистиллированной воды и один объем подвески спор в двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку.
Установите эту aqueous смесь обработки в сторону для хлороформ основе цветочного экстракта bioassays. В дым капот, поместите Ван T Cell на стеклянную крышку в подготовленных пластиковых клеток культуры блюдо. Выдайте 33 микролитров желаемого хлороформного цветочного экстракта в центр клетки и дайте высохнуть.
Не прикасайтесь к стенам клетки. Для контрольного лечения добавьте девственную хлороформ. После того, как хлороформ на основе цветочного экстракта высохнет, обойтись 99 микролитров подготовленной аквеусной смеси обработки со стандартной пипеткой в центре Van T Cell.
Затем закройте все блюда клеточной культуры и инкубировать. В заранее определенные моменты времени, добавить 15 микролитров фиксатора в Van T Cell и дайте ему сидеть, по крайней мере пять минут, чтобы обеспечить адекватное грибковое окрашивание. После этого времени, тщательно удалите Van T Cell.
Выполните шаги по инверсии и сбору данных, как и прежде. При микроскопической оценке C.fiorniae в течение 24 часов после прививки, сравнение конидии в присутствии стерильной дистиллированной воды по сравнению с цветочным экстрактом на водной основе показывает резкое увеличение вторичного конидиции и образования аппрессория. Однако вторичное конидиация была не так очевидна при сравнении хлороформного биоанализа стерильного дистиллированного контроля воды с экстрактами на основе хлороформа.
Скорее, рост C.fiorniae сместился в сторону апрессориального образования. В этом анализе, стерильные дистиллированной воды контроля и клюквы хлороформ основе цветочных извлечений были визуально проверены на нуле, шесть, 12 и 24 часов после прививки. Образование аппрессория началось в шесть часов в цветочном экстракте на основе хлороформа и неуклонно увеличивалось в течение последующих точек времени.
Этот результат подтверждает вывод о том, что цветы сокращают время, необходимое для формирования инфекционных структур. Управление заболеванием для фруктовых гниющих грибов часто включает в себя время цветения фунгицидов приложений. Здесь экстракты клюквенного хлороформа на основе нескольких стадий роста клюквы были визуально оценены для эффективного поверхностного воска на C.fiorniae в течение 24 часов после прививки.
Яичники, собранные в июне, незрелые фрукты, собранные в июле, а в августе, собранные фрукты, собранные в октябре, и стерильный дистиллированной воды контроля были проверены на аппрессориальное образование. Экстракты на основе хлороформа яичников имели наибольшую величину аппрессориального образования, что указывает на важность цветения в жизненном цикле C.fiorniae. Патоген является наиболее важным компонентом этого протокола.
Грибы должны быть перемещены в свежие средства массовой информации регулярно, чтобы сохранить последовательность между испытаниями. Любая работа с хлороформом должна выполняться в дымовом капоте по соображениям безопасности. Это включает в себя подготовку материалов и стеклянной посуды, процедуры экстракции, а также проведение биоанализа на основе хлороформа.
Комбинации точек времени, патогенных микроорганизмов, цветочных коллекций дождевой воды или экстракции хозяина могут быть использованы для оценки различных взаимодействий хозяина и патогена. Устройства сбора дождевой воды и связанные с ними биоанализы позволят другим работать с стимуляторами-хозяинами, мобилизованными во время дождевых событий в многочисленных системах траектории.
