Este protocolo fornece um sistema barato e adaptável para avaliar a dinâmica temporal das pistas fluoroquímicas em Colletotrichum fiorniae e outros patógenos vegetais que infectam o termo bloom. Novos dispositivos de coleta de água da chuva permitem que o usuário monitore estimulantes naturais e condições que afetam o desenvolvimento de patógenos de forma quase em tempo real. Inicie este procedimento com uma cultura de Colletotrichum fiorniae de um hospedeiro naturalmente infectado, como descrito no protocolo de texto.
Quando as colônias começam a esporular, listrar conidia em outro ágar V 8 Juice contendo prato de cultura celular para produzir uma cultura esporulante de alta densidade. Após sete dias de crescimento, use um laço estéril padrão para coletar uma pequena quantidade de conídio da cultura de alta densidade, tocando levemente o laço para a massa conidial. Misture isso em um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 10 mililitros de água deionizada estéril.
Vórtice esta amostra por 10 segundos. Usando uma pipeta padrão, mergulhe várias vezes para misturar ainda mais a amostra. Em seguida, coloque uma gota da amostra vórtice no hemótmetro e estime as concentrações de esporos.
Ajuste a concentração para 0,1 milhão de conidia por mililitro de água destilada estéril com um volume final de cinco mililitros. Isso é referido como a suspensão do esporo e só é feito imediatamente antes de ser usado em qualquer bioensaio. Para realizar a extração floral à base de clorofórmio, limpe todos os componentes com 95% de etanol duas vezes.
Em seguida, limpe os componentes duas vezes com clorofórmio para evitar contaminação para cada extração. Não limpe as tampas forradas do PTFE com clorofórmio, pois as danificará. Após a limpeza, reserve os componentes para secar de cabeça para baixo.
Combine uma parte das flores processadas a nove partes de clorofórmio em um béquer adicionando flores e, em seguida, clorofórmio. Gire suavemente por 30 segundos e coe através de uma tela de aço inoxidável no segundo béquer. Despeje o extrato à base de clorofórmio do segundo béquer no tubo de cultura de vidro e afixe a tampa PTFE.
Enrole a tampa com parafilm para evitar a evaporação. Armazene o extrato floral à base de clorofórmio resultante na escuridão para reduzir a degradação da luz a quatro graus Celsius até o uso experimental. Repita extrações com várias amostras para fornecer réplicas.
Para criar um dispositivo de coleta para cada local selecionado, use um passo ligado a uma prensa de perfuração para fazer um furo na parte inferior de um copo de spray. Em seguida, corte uma linha reta do topo do buraco até a boca do copo de spray. Agora faça quatro orifícios equidistantes grandes o suficiente para enfiar o fio revestido de plástico na boca do copo de spray.
Conecte uma extremidade dos fios revestidos de plástico deixando uma extremidade livre. Faça um furo grande o suficiente para enfiar o spray de tinta ou o adaptador de copo em uma tampa de tampa centrífuga de 50 mililitros. Sele os fios do adaptador com parafilm para evitar vazamentos.
Coloque-o tanto na tampa centrífuga quanto na porção roscada do copo do pulverizador. Em seguida, conecte o tubo de centrífuga de 50 milímetros acasalado. Crie quatro dispositivos de coleta por local de amostragem.
Implante dispositivos em locais selecionados flexionando copos de pulverizador para caber em hastes. Oriente o lado cortado do copo do pulverizador para cima usando os fios revestidos de plástico presos a outras hastes. Isso garante que a água que passa sobre as flores seja capturada.
Para coletar água da chuva de flores de cranberry, primeiro o calor pune oito orifícios equidistantes ao redor da boca do funil usando uma sonda de metal. Insira laços de torção em quatro dos orifícios. Conecte as outras extremidades ao local oposto desse buraco formando um padrão de cruzamento limpo.
Enrole o funil a vapor com parafilm e reserve. Faça um furo grande o suficiente para inserir o funil para baixo em uma tampa centrífuga de 50 mililitros com um passo. Insira o funil preparado na tampa centrífuga.
Após a chuva ou a irrigação aérea, remova e substitua a porção inferior do tubo de centrífuga. Os tubos de coleta de água da chuva devem ser rapidamente alterados após eventos de molhar, pois são propensos à degradação de contaminantes naturais mobilizados no escoamento, como bactérias e outros fungos. Coloque duas camadas de discos de papel dentro de pratos culturais e mergulhe com dois mililitros de água destilada estéril.
Em seguida, misture volumes iguais de água destilada e extrato floral à base de água em dois tubos de microcentrífugo mililitro. Em seguida, adicione um volume igual da suspensão do esporo aos dois tubos de microcentrífugo preparados. A preparação resultante é referida como uma mistura de tratamento aquoso.
Para o controle, omita a porção do extrato floral e substitua por água destilada estéril para manter as concentrações conidiais consistentes. Agora coloque tampas de vidro pré-limpas em cima das toalhas de papel encharcadas dentro do prato de cultura celular. Coloque uma gota de 40 microliter de mistura de tratamento aquoso no centro de uma tampa.
Repita isso para tratamentos desejados, incluindo o controle. Em seguida, fechar o prato cultura celular. Uma vez dispensados todos os tratamentos e réplicas, coloque todos os pratos de cultura celular replicados em um recipiente plástico selado e incubar a 25 graus Celsius no escuro.
Em pontos de tempo pré-determinados, adicione 10 microliters de fixação às gotículas parando o crescimento e semi-preservando a montagem. Uma vez que um fixador tenha sido adicionado, inverta cuidadosamente as tampas colocando cada um deles lado gotícula para baixo em um slide de microscópio de vidro para facilitar o exame microscópico. Quando todas as tampas estiverem nos slides do microscópio de vidro, deixe-as se acomodar e seque parcialmente no capô de fluxo por 20 minutos.
Conte todas as conídias presentes no deslizamento de cobertura, incluindo coníscia primária, coníddia germinada, e conidia secundária recém-formada, bem como apressoria. Trabalhe em 400 vezes ou 200 vezes, totalizando uma área de 3.808 milímetros quadrados. Em uma capa de fluxo laminar, adicione dois volumes iguais de água destilada estéril e um volume de suspensão de esporos a um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Reserve esta mistura de tratamento aquoso para bioensaões de extrato floral à base de clorofórmio. Em um capô de fumaça, coloque uma Célula Van T em uma tampa de vidro dentro do prato de cultura de células plásticas preparadas. Dispense 33 microliters de extrato floral desejado à base de clorofórmio no centro da célula e deixe secar.
Não toque nas paredes da cela. Para o tratamento de controle, adicione clorofórmio virgem. Uma vez que o extrato floral à base de clorofórmio tenha secado, dispense 99 microliters da mistura de tratamento aquoso preparada com uma pipeta padrão no centro da Célula Van T.
Em seguida, feche todos os pratos da cultura celular e incubar. Em pontos de tempo pré-determinados, adicione 15 microlitadores de um fixador à Célula Van T e deixe descansar por pelo menos cinco minutos para garantir a coloração fúngica adequada. Depois desse tempo, remova cuidadosamente a célula Van T.
Executar etapas de inversão de deslizamentos e de aquisição de dados como antes. Após avaliação microscópica de C.fiorniae às 24 horas após a inoculação, a comparação da conidia na presença de água destilada estéril versus extrato floral à base de água revela um aumento dramático na conidição secundária e na formação de apressorium. No entanto, a conidição secundária não foi tão aparente quando comparamos o bioensato de clorofórmio estéril controle de água destilado com extratos à base de clorofórmio.
Em vez disso, o crescimento de C.fiorniae mudou para a formação apressorial. Neste ensaio, um controle de água destilado estéril e extrações florais à base de clorofórmio de cranberry foram inspecionados visualmente a zero, seis, 12 e 24 horas após a inoculação. A formação de appressorium começou em seis horas no extrato floral à base de clorofórmio e aumentou constantemente ao longo dos pontos de tempo subsequentes.
Esse resultado corrobora a constatação de que as flores reduzem o tempo necessário para formar estruturas de infecção. O manejo de doenças para fungos apodrecidos de frutas muitas vezes envolve aplicações de fungicidas em tempo de floração. Aqui, extratos à base de clorofórmio de cranberry de múltiplos estágios de crescimento de cranberry foram avaliados visualmente para as ceras de superfície eficazes em C.fiorniae às 24 horas após a inoculação.
Os ovários coletados em junho, frutas imaturas coletadas em julho e, em agosto, frutas colhidas coletadas em outubro, e um controle de água destilado estéril foram inspecionados para formação apressorial. Extratos à base de clorofórmio tiveram a maior magnitude da formação apressorial indicando a importância da floração no ciclo de vida de C.fiorniae. O patógeno é o componente mais importante deste protocolo.
Os fungos devem ser movidos para novas mídias rotineiramente para manter a consistência entre os ensaios. Qualquer trabalho com clorofórmio deve ser realizado em um capô de fumaça por razões de segurança. Isso inclui a preparação de materiais e vidros, procedimentos de extração e condutância do bioensaio à base de clorofórmio.
Combinações de pontos de tempo, patógenos, coleções florais de água da chuva ou extrações de hospedeiros podem ser utilizadas para avaliar várias interações hospedeiro-patógeno. Os dispositivos de coleta de água da chuva e os bioensa periódicos associados permitirão que outros trabalhem com estimulantes de hospedagem mobilizados durante eventos pluviais em inúmeros sistemas de caminhos.
