هذه طريقة لتطبيق التحفيز الكهروميكانيكي على الخلايا. لديها تطبيقات متعددة لدراسة آثاره على مجموعة الخلايا، والتدريب المسبق لفي تسليم الجسم الحي، ونضج الخلايا. ميزة هي أن المحفزات الكهربائية والميكانيكية يمكن تطبيقها مع نفس الجهاز بشكل فردي أو في وقت واحد مع الحفاظ على سلامة الفيروسية العقيمة.
هذه التقنية هي نهج غير مباشر لعلاجنا. العلاج الخلوي يعتبر الخلايا المحفزة كهربائيا قد تكون الخلايا مثيرة للاهتمام لعلاج مقدمة عضلة القلب. هذه الطريقة تنتمي عموما إلى مجال القلب والأوعية الدموية، ولكن يمكن أيضا أن تطبق على الجهاز العصبي.
هذه هي تقنية سهلة تتطلب الصبر. الجزء الأكثر صعوبة سيكون العمل مع القطع الصغيرة، والحفاظ على العقم في جميع أنحاء. هناك تفاصيل قليلة عن التلاعب التي يصعب شرحها ، لذلك فإن العرض المرئي مفيد حقا.
تبدأ عن طريق نقل 12 تنظيفها بنيات PDMS إلى 10 لوحات معقمة سم. لضمان التعقيم الكامل، يعرض لوحات للأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. ثم نقل كل بناء إلى منفصلة 35 خلية خلية لوحة، أو لوحات 6-جيدا لبذور الخلية الفورية.
لبدء بذر الخلايا، أولا غسل قارورة T75 ناقم من ATDPCs القلب مع خمسة ملليلترات من 1X PBS. لفصل الخلايا، أضف ملليلتر واحد من 0.05٪ تبسين-EDTA. واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم، إضافة خمسة ملليلتر من المتوسط الكامل لإلغاء تنشيط التربسين-EDTA. جمع جميع الخلايا المنفصلة في أنبوب 15 ملليلتر. اغسل زجاج الخلية مرتين بخمسة ملليلترات من برنامج تلفزيوني لجمع أي خلايا متبقية ، وإضافتها إلى أنبوب 15 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي في 230 غرام لمدة خمس دقائق في 22 درجة مئوية. إزالة فائقة، وإعادة تعليق الخلايا في مليلترين من المتوسط الكامل، وعدها مع مقياس الهيموسيت. بذور 200 ميكرولترات من ATDPCs القلب في كل لوحة مع بنيات PDMS للحصول على حوالي 80٪ من سطح البذر التي تغطيها الخلايا في اليوم التالي.
احتضان في 37 درجة مئوية، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. أضف بلطف 2 ملليلتر من متوسطة كاملة مسبقة التدفئة لكل لوحة. احتضان الخلايا مع الانشاءات في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
قبل البدء في هذا الإجراء، تعيين ستة من أصل 12 ثوابت للتحفيز الكهروميكانيكية، والحفاظ على ستة لعناصر تحكم غير محفزة. استخدام 70٪ الإيثانول لتنظيف وحدة التحفيز. ضع وحدة التحفيز والأقطاب الكهربائية المعقمة والملاقط داخل خزانة التدفق.
من أجل التلاعب بسهولة الأقطاب والانشاءات، وإزالة 90٪ من المتوسطة من كل لوحة ثقافة الخلية. ضع بنيات PDMS في الموضع الصحيح نحو المغناطيس لضمان الجذب المغناطيسي بين كل من المغناطيس الثابت والمتحرك. هذه الخطوات السابقة اثنين التي يمكنك التعامل مع بنيات PDMS الخلية المصنفة والأقطاب الكهربائية مع الحفاظ على العقم في جميع أنحاء العملية هي الأكثر أهمية.
ثم، قم بتوصيل السلك البلاتيني بموصلات القطب. توجيه الجزء PTFE من الأقطاب الكهربائية في المساحات المخصصة لها في بنيات PDMS. إضافة 2.5 ملليلتر من الطازجة، قبل الدافئة المتوسطة كاملة لكل بناء.
بمجرد وضع جميع بنيات PDMS وتوصيلها كهربائيًا بالمنصة ، ضع المنصة مرة أخرى في 37 درجة مئوية ، وحاضنة CO2 بنسبة 5٪. ثم قم بتوصيل المصدر الكهربائي والميكانيكي. لتكوين برنامج التحفيز، حدد أنظمة التحفيز الكهربائي والميكانيكية من خلال واجهات المستخدم للمحفز الكهربائي والتطبيق، الذي يتحكم في التحفيز الميكانيكي.
لضبط التزامن، قم بالتبديل على جهاز التحفيز الكهربائي وانتظر حتى تظهر القائمة الرئيسية على الشاشة. ثم حدد الخيار الثاني، تحرير التسلسل، بالإضافة إلى إدخال. لتحرير قائمة التسلسل، استخدم علامة التبويب الوضع لتحديد الحالي"بالنقر فوق زائد"والضغط على Enter"للفترة، حدد 1000 "مع زائد / ناقص والصحافة Enter"وعلامة التبويب وضع الزناد، حدد الخارجية من قبل البرنامج واضغط على Enter"لعلامة التبويب السعة، حدد 1 "مع زائد / ناقص والصحافة Enter"ثم، مرة أخرى في القائمة الرئيسية، حدد الخيار 4، ومن ثم توليد تسلسل، والصحافة "في قسم التحفيز الميكانيكية من لوحة تطبيق التحكم، أولا كتابة 1000"في نقطة تحكم النص زائد الفترة.
ثم اكتب 500 "في التحكم في الوقت على النص، لتعيين مدة النبض الميكانيكية. وأخيرا ، اكتب 2000 "في مراقبة النص رحلة لتقديم 10 ٪ بناء إستطالة. تغيير وسائط الخلايا مرتين في الأسبوع، عن طريق إزالة الوسائط القديمة أولاً، ثم إضافة وسائط ساخنة، طازجة على جانبي دعم PDMS.
في اليوم السابع، في نهاية التجربة، قم بجمع العينات كما هو موضح في المخطوطة. تنشيط كهربائيا القلب ATDPCs تعزيز إمكاناتها القلبية. وقد أشار إلى ذلك من قبل PCR في الوقت الحقيقي تظهر زيادة التعبير عن جينات القلب في وقت مبكر ومتأخر على وجه التحديد عامل النسخ القلبي GATA-4، وعلامة بيتا-ميوسين الهيكلية الثقيلة سلسلة، والمورثات ذات الصلة الكالسيوم Connexin43.
Phalloidin تلطيخ ضد ألياف actin أظهرت أن غالبية الخلايا الانحياز وفقا للنمط الرأسي. وكان توزيع Connexin43 في الغالب في السيتوبلازم، وفي غشاء البلازما، مما ساهم في الاتصالات داخل الخلايا من خلال الوصلات الفجوة. تم تحديد عوامل النسخ MEF2 و GATA-4 في النوى في ATDPCs القلبية.
ولكن لم يتم اكتشاف جاتا-4 في البلدان تحت الجلد ATDPCs. علامات السيتوبلازمية SERCA2، وساركMERIC ألفا actinin، لم تظهر منظمة ساركومير ناضجة نموذجية لcocomyocytes. ولم يلاحظ الضرب في السيطرة وتحفيز مجموعات الخلايا.
خلية صحية أحادية في بداية هذا البروتوكول والحفاظ على العقم طوال العملية حاسمة. بعد جمع العينات، يمكن تنفيذ تقنيات التعبير عن بروتين الجينوم القياسية. هذه التقنية تساعد على فهم أفضل لتأثير الخلايا الكهربائية و / أو المحفزات الميكانيكية.
حتى وقت قريب، كان من المستحيل استخدام نفس الجهاز لكلا التحفيز، مما جعل من الصعب مقارنة النتائج.
