Dies ist eine Methode, um elektromechanische Stimulation auf Zellen anzuwenden. Es hat mehrere Anwendungen, um seine Auswirkungen auf eine Zellpopulation zu studieren, Vortraining für In-vivo-Lieferung, und Zellreifung. Der Vorteil ist, dass elektrische und mechanische Reize mit dem gleichen Gerät einzeln oder gleichzeitig angewendet werden können, während sterile virale intakt bleiben.
Diese Technik ist ein indirekter Ansatz für unsere Therapie. Zelltherapie gilt als elektromechanisch stimulierte Zellen kann eine interessante Zellpopulation zur Behandlung von Intro-Myokard sein. Diese Methode gehört in der Regel zum Kardiovaskulärfeld, aber es könnte auch auf das Nervensystem angewendet werden.
Dies ist eine einfache Technik, die Geduld erfordert. Der schwierigste Teil wird sein, mit den kleinen Stücken zu arbeiten, und halten Die Sterilität durchweg. Es gibt kleine Details der Manipulation, die schwer zu erklären sind, so dass die visuelle Demonstration wirklich hilfreich ist.
Beginnen Sie mit der Übertragung von 12 gereinigten PDMS-Konstruktionen auf sterile 10-Zentimeter-Platten. Um eine vollständige Sterilisation zu versichern, setzen Sie die Platten fünf Minuten lang UV-Licht aus. Übertragen Sie dann jedes Konstrukt auf eine separate 35-Millimeter-Zellkulturplatte oder 6-Well-Platten für die sofortige Zellaussaat.
Um mit der Zellaussaat zu beginnen, waschen Sie zunächst einen konfluenten T75-Kolben kardialer ATDPCs mit fünf Millilitern 1x PBS. Um die Zellen zu lösen, fügen Sie einen Milliliter 0,05%trypsin-EDTA hinzu. Und bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten brüten.
Fügen Sie dann fünf Milliliter komplettes Medium hinzu, um die Trypsin-EDTA zu inaktivieren. Sammeln Sie alle getrennten Zellen in einem 15 Milliliter Rohr. Waschen Sie das Zellglas zweimal mit fünf MilliliterPBS, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und fügen Sie es in die 15 Milliliter Tube.
Zentrifuge bei 230 g für fünf Minuten bei 22 Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen in zwei Milliliter neines vollständigen Mediums wieder auf, und zählen Sie sie mit dem Hämozytometer. Samen 200 Mikroliter Herz-ATDPCs in jede Platte mit dem PDMS konstruktiert, um etwa 80% der Säfläche von Zellen bedeckt am nächsten Tag zu erhalten.
Inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% CO2. Fügen Sie vorsichtig 2 Milliliter vorgewärmtes komplettes Medium pro Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit den Konstrukten bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 über Nacht.
Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, weisen Sie sechs von 12 Konstrukten für die elektromechanische Stimulation zu, und halten Sie sechs für nicht stimulierte Steuerungen. Verwenden Sie 70% Ethanol, um die Stimulationseinheit zu reinigen. Legen Sie die Stimulationseinheit, sterile Elektroden und Pinzette in den Durchflussschrank.
Um die Elektroden und Konstrukte leicht zu manipulieren, entfernen Sie 90% des Mediums aus jeder Zellkulturplatte. Platzieren Sie die PDMS-Konstrukte in der richtigen Position in Richtung des Magneten, um die magnetische Anziehungskraft zwischen festen und mobilen Magneten zu versichern. Diese beiden vorherigen Schritte, in denen Sie die gesäten PDMS-Konstrukte der Zelle und die Elektroden manipulieren, während die Sterilität während des gesamten Prozesses beibehalten wird, sind die kritischsten.
Schließen Sie dann den Platindraht an die Elektrodenverbinder an. Richten Sie den PTFE-Teil der Elektroden in ihren vorgesehenen Räumen in den PDMS-Konstrukten aus. Fügen Sie 2,5 Milliliter frisches, vorgewärmtes komplettes Medium zu jedem Konstrukt hinzu.
Sobald alle PDMS-Konstrukte platziert und elektrisch mit der Plattform verbunden sind, platzieren Sie die Plattform wieder in den 37 Grad Celsius und 5%CO2-Inkubator. Schließen Sie dann die elektrische und mechanische Quelle an. Um das Stimulationsprogramm zu konfigurieren, geben Sie elektrische und mechanische Stimulationsregime über die Benutzeroberflächen des elektrischen Stimulaators und der Anwendung an, die die mechanische Stimulation steuert.
Um die Synchronität einzustellen, schalten Sie den elektrischen Stimulator ein, und warten Sie, bis das Hauptmenü auf dem Display angezeigt wird. Wählen Sie dann Option zwei, Bearbeitungssequenz plus Enter aus. Um das Sequenzmenü zu bearbeiten, verwenden Sie die Registerkarte Modus, um current auszuwählen, indem Sie auf Plus klicken" und drücken Sie die Eingabetaste"Für den Zeitraum, Wählen Sie 1000"mit Plus/Minus und drücken Sie die Registerkarte "Eingabemodus" Und drücken Sie die Taste "Für die Amplituden-Registerkarte" wählen Sie 1"mit Plus/Minus aus und drücken Sie die Taste"Dann, zurück ins Hauptmenü, wählen Sie Option 4 aus, und erzeugen Sie dann die Sequenz, und drücken Sie "Im mechanischen Stimulationsbereich des Bedienfelds 1000" in der Plusperioden-Textsteuerung.
Schreiben Sie dann 500"in die ON-Zeittextsteuerung, um die mechanische Pulsdauer einzustellen. Schreiben Sie schließlich 2000"in das Exkursionstextsteuerelement, um eine 10%construct Dehnung zu liefern. Ändern Sie die Zellmedien zweimal pro Woche, indem Sie zuerst die alten Medien entfernen und dann warme, frische Medien an den Seiten der PDMS-Unterstützung hinzufügen.
Am siebten Tag, am Ende des Experiments, sammeln Sie die Proben, wie im Manuskript beschrieben. Elektromechanisch stimulierte kardiale ATDPCs verbesserten ihr kardiomyogenes Potenzial. Dies wurde durch Echtzeit-PCR angezeigt, die eine erhöhte Expression von frühen und späten Herzgenen zeigten, insbesondere den kardialen Transkriptionsfaktor GATA-4, den Strukturmarker Beta-Myosin-schwere Kette und das kalziumverwandte Gen Connexin43.
Phalloidin Färbung gegen Aktinfasern zeigte, dass die Mehrheit der Zellen nach dem vertikalen Muster ausgerichtet. Die Connexin43-Verteilung erfolgte hauptsächlich im Zytoplasma und in der Plasmamembran und trug zur intrazellulären Kommunikation durch Spaltknoten bei. MEF2- und GATA-4-Transkriptionsfaktoren wurden an den Kernen in kardialen ATDPCs lokalisiert.
Aber GATA-4 wurde nicht in subkutanen ATDPCs nachgewiesen. Die zytoplasmatischen Marker SERCA2 und sarcomeric alpha-actinin zeigten keine reife Sarkome-Organisation, die typisch für Kardiomyozyten ist. Und Schlagen wurde nicht bei der Kontrolle beobachtet und stimulierte Zellpopulationen.
Eine gesunde Zellmonolayer zu Beginn dieses Protokolls und die Beibehaltung der Sterilität während des gesamten Verfahrens sind entscheidend. Nach der Probenentnahme können die Standard-Genomproteinexpressionstechniken durchgeführt werden. Diese Technik hilft, die Wirkung von elektrischen und/oder mechanischen Reizen der Zelle besser zu verstehen.
Bis vor kurzem war es unmöglich, das gleiche Gerät für beide Stimulationen zu verwenden, was den Vergleich der Ergebnisse erschwerte.
