Este é um método para aplicar estimulação eletromecânica nas células. Possui múltiplas aplicações para estudar seus efeitos sobre uma população celular, pré-treinamento para entrega in vivo e maturação celular. A vantagem é que estímulos elétricos e mecânicos podem ser aplicados com o mesmo dispositivo individualmente ou simultaneamente, mantendo intacto o viral estéril.
Esta técnica é uma abordagem indireta para nossa terapia. A terapia celular é considerada células eletromecanicamente estimuladas pode ser uma população celular interessante para tratar o intro-miocárdio. Esse método geralmente pertence ao campo cardiovascular, mas também pode ser aplicado ao sistema nervoso.
Esta é uma técnica fácil que requer paciência. A parte mais difícil será trabalhar com as pequenas peças, e manter a esterilidade por toda parte. Há pequenos detalhes de manipulação que são difíceis de explicar, por isso a demonstração visual é realmente útil.
Comece transferindo 12 construções PDMS limpas para placas estéreis de 10 centímetros. Para assegurar a esterilização completa, exponha as placas à luz UV por cinco minutos. Em seguida, transfira cada construção para uma placa de cultura celular separada de 35 milímetros, ou placas de 6 poços para semeadura celular imediata.
Para iniciar a semeadura celular, primeiro lave um frasco confluente T75 de ATDPCs cardíacos com cinco mililitros de 1x PBS. Para desapegar as células, adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA. E incubar a 37 graus Celsius por cinco minutos.
Em seguida, adicione cinco mililitros de meio completo para inativar o trypsin-EDTA. Colete todas as células separadas em um tubo de 15 mililitros. Lave o vidro celular duas vezes com cinco mililitros de PBS para coletar quaisquer células restantes, e adicione-as ao tubo de 15 mililitros.
Centrífuga a 230 g por cinco minutos a 22 graus Celsius. Remova o supernatário e suspenda as células em dois mililitros de meio completo, e conte-as com o hemótmetro. Semente 200 microliters de ATDPCs cardíacos em cada placa com o PDMS constrói para obter cerca de 80% da superfície de semeadura coberta por células no dia seguinte.
Incubar a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Adicione suavemente 2 mililitros de meio completo pré-aquecido por placa. Incubar as células com os construtos a 37 graus Celsius, e 5% de CO2 durante a noite.
Antes de iniciar este procedimento, atribua seis das 12 construções para estimulação eletromecânica e mantenha seis para controles não estimulados. Use 70% de etanol para limpar a unidade de estimulação. Coloque a unidade de estimulação, eletrodos estéreis e pinças dentro do armário de fluxo.
Para manipular facilmente os eletrodos e construtos, remova 90% do meio de cada placa de cultura celular. Coloque os construções PDMS na posição certa em direção ao ímã para assegurar atração magnética entre ímãs fixos e móveis. Estas duas etapas anteriores em que você manipula as construções PDMS semeadas da célula e os eletrodos, mantendo a esterilidade durante todo o processo são as mais críticas.
Em seguida, conecte o fio de platina aos conectores do eletrodo. Oriente a parte PTFE dos eletrodos em seus espaços designados nas construções PDMS. Adicione 2,5 mililitros de meio completo fresco e pré-aquecido a cada construção.
Uma vez que todos os construtos PDMS são colocados e conectados eletricamente à plataforma, coloque a plataforma de volta para a incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2. Em seguida, conecte a fonte elétrica e mecânica. Para configurar o programa de estimulação, especifique regimes de estimulação elétrica e mecânica através das interfaces de usuário do estimulador elétrico e da aplicação, que controla a estimulação mecânica.
Para definir o sincronizador, ligue o estimulador elétrico e aguarde que o menu principal apareça no visor. Em seguida, selecione a opção dois, edite sequência, além de Enter. Para editar o menu sequência, use a guia de modo para selecionar a corrente"clicando em mais"e pressionando Enter"Para o período, selecione 1000"com mais/menos e pressione Enter"E para a guia do modo de gatilho, selecione externo por software e pressione Enter"Para a guia de amplitude, selecione 1"com mais/menos e pressione Enter"Em seguida, de volta no menu principal, selecione a opção 4 e, em seguida, gere sequência e pressione Enter"Na seção de estimulação mecânica do painel do aplicativo de controle, primeiro escreva 1000"no controle de texto de período mais.
Em seguida, escreva 500""no controle de texto on time, para definir a duração do pulso mecânico. Finalmente, escreva 2000"no controle de texto de excursão para entregar um alongamento de construção de 10%. Mude a mídia celular duas vezes por semana, primeiro removendo a mídia antiga e, em seguida, adicionando mídia quente e fresca nas laterais do suporte pdms.
No sétimo dia, no final do experimento, colete as amostras conforme descrito no manuscrito. ATDPCs cardíacos eletromecanicamente estimulados aumentaram seu potencial cardiomiogênico. Isso foi indicado pelo PCR em tempo real mostrando aumento da expressão de genes cardíacos precoces e tardios especificamente o fator de transcrição cardíaca GATA-4, a cadeia pesada de marcadores estruturais beta-miosina, e o gene relacionado ao cálcio Connexin43.
A mancha de faloides contra fibras de actina mostrou que a maioria das células se alinhava de acordo com o padrão vertical. A distribuição connexin43 foi principalmente no citoplasma, e na membrana plasmática, contribuindo para a comunicação intracelular através de junções de lacunas. Os fatores de transcrição mef2 e GATA-4 foram localizados nos núcleos em ATDPCs cardíacos.
Mas o GATA-4 não foi detectado em ATDPCs subcutâneos. Os marcadores citoplasmados SERCA2, e alfa-actinina sarcomeric, não mostraram uma organização sarcomere madura típica para cardiomiócitos. E o espancamento não foi observado no controle e estimulou as populações celulares.
Uma monocamada celular saudável no início deste protocolo e manter a esterilidade durante todo o procedimento são cruciais. Após a coleta da amostra, as técnicas padrão de expressão da proteína do genoma podem ser realizadas. Esta técnica ajuda a entender melhor o efeito dos estímulos elétricos e/ou mecânicos das células.
Até recentemente, era impossível usar o mesmo dispositivo para ambos os estímulos, o que tornava os resultados mais difíceis de comparar.
