Это метод применения электромеханической стимуляции на клетках. Он имеет несколько применений для изучения его воздействия на популяцию клеток, предварительной подготовки для доставки in vivo, и созревания клеток. Преимущество заключается в том, что электрические и механические стимулы могут быть применены с тем же устройством индивидуально или одновременно, сохраняя при этом стерильные вирусные нетронутыми.
Этот метод является косвенным подходом к нашей терапии. Клеточная терапия считается электромеханически стимулировали клетки могут быть интересные популяции клеток для лечения интро-миокарда. Этот метод обычно относится к сердечно-сосудистой области, но он также может быть применен к нервной системе.
Это простой метод, который требует терпения. Самая трудная часть будет работать с маленькими кусочками, и держать стерильность во всем. Есть маленькие детали манипуляции, которые трудно объяснить, так что визуальная демонстрация действительно полезно.
Начните с передачи 12 очищенных конструкций PDMS на стерильные 10-сантиметровые пластины. Чтобы обеспечить полную стерилизацию, подвергайте пластины ультрафиолетовому свету в течение пяти минут. Затем перенесите каждую конструкцию в отдельную 35-миллиметровую пластину клеточной культуры, или 6-хорошо пластины для немедленного посева клеток.
Чтобы начать посев клеток, сначала промойте стеченную колбу T75 сердечных АТОР с пятью миллилитров 1x PBS. Чтобы отделить клетки, добавьте один миллилитр 0,05%трипсина-ЭДТА. И инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Затем добавьте пять миллилитров полной среды, чтобы инактивировать трипсин-ЭДТА. Соберите все отдельные клетки в 15 миллилитровую трубку. Вымойте клеточное стекло дважды с пятью миллилитров PBS, чтобы собрать все оставшиеся клетки, и добавить их в 15 миллилитров трубки.
Центрифуга при 230 г в течение пяти минут при 22 градусах по Цельсию. Удалите супернатант и повторно приостановите клетки в двух миллилитров полной среды, и подсчитайте их с гемоцитометром. Семя 200 микролитров сердечных ATDPCs в каждой пластине с PDMS конструкций для получения около 80% поверхности посева покрыты клетками на следующий день.
Инкубация при 37 градусах по Цельсию и 5%CO2. Аккуратно добавьте 2 миллилитров предварительно разогретой полной среды на тарелку. Инкубировать клетки с конструкциями при 37 градусах по Цельсию, и 5%CO2 в одночасье.
Перед началом этой процедуры назначьте шесть из 12 конструкций для электромеханической стимуляции и держите шесть для не стимулированных элементов управления. Используйте 70% этанола для очистки блока стимуляции. Поместите блок стимуляции, стерильные электроды и пинцет внутри шкафа потока.
Для того, чтобы легко манипулировать электродами и конструкциями, удалите 90% среды из каждой пластины культуры клеток. Поместите конструкции PDMS в нужное положение к магниту, чтобы обеспечить магнитное притяжение между фиксированными и мобильными магнитами. Эти два предыдущих шага, в которых вы манипулировать клетки семенами PDMS конструкций и электродов, сохраняя при этом стерильность на протяжении всего процесса являются наиболее важными.
Затем подключите платиновый провод к разъемам электрода. Ориентация PTFE часть электродов в назначенных пространствах в конструкции PDMS. Добавьте 2,5 миллилитров свежей, предварительно разогретой полной среды к каждой конструкции.
После того, как все конструкции PDMS размещены и электрически подключены к платформе, поместите платформу обратно в 37 градусов по Цельсию, и 5%CO2 инкубатор. Затем соедините электрический и механический источник. Для настройки программы стимуляции укажите режимы электрической и механической стимуляции через пользовательские интерфейсы электрического стимулятора и приложения, которое контролирует механическую стимуляцию.
Чтобы установить синхронизацию, включите электрический стимулятор и дождитесь, пока на дисплее появится основное меню. Затем выберите вариант два, редактировать последовательность, а также введите. Чтобы отредактировать меню последовательности, используйте вкладку режима, чтобы выбрать ток "нажав плюс" и нажав Enter"На период, выберите 1000 "с плюсом / минусом и нажмите Enter"И для запуска режима вкладке, выберите внешний программного обеспечения и нажмите Enter "Для амплитуды вкладке, выберите 1"с плюс / минус и нажмите Enter "Тогда, обратно в основное меню, выберите вариант 4, а затем генерировать последовательность, и нажмите Enter"В механической стимуляции разделе панели приложения управления, сначала написать 1000 "в плюс период управления текстом.
Затем напишите 500 "в ON управления текстом времени, чтобы установить продолжительность механического импульса. Наконец, напишите 2000"в управлении текстом экскурсии, чтобы доставить 10%-конструкцию удлинения. Изменение сотовых средств массовой информации два раза в неделю, сначала удаление старых средств массовой информации, а затем добавить теплые, свежие средства массовой информации по бокам поддержки PDMS.
На седьмой день, в конце эксперимента, соберите образцы, описанные в рукописи. Электромеханически стимулируемые сердечные ЦИНДК повысили их кардиомиогенный потенциал. Об этом свидетельствуют ПЦР в режиме реального времени, показывающие повышенную экспрессию ранних и поздних сердечных генов, в частности, сердечного транскрипционные факторы GATA-4, структурная маркерная бета-миозин тяжелая цепь и связанный с кальцием ген Connexin43.
Фаллоидин окрашивания против актиновых волокон показал, что большинство клеток выровнены в соответствии с вертикальной картины. Распределение Connexin43 было главным образом в цитоплазме, и на мембране плазмы, способствуя к внутриклеточной связи через соединения зазора. Факторы транскрипции MEF2 и GATA-4 были обнаружены в ядрах сердечных АТАДК.
Но GATA-4 не был обнаружен в подкожных ATDPCs. Цитоплазмические маркеры SERCA2 и саркомерный альфа-актинин не показывают зрелой саркомерной организации, характерной для кардиомиоцитов. А избиение не наблюдалось в контроле и стимулировало популяции клеток.
Здоровый монослой клеток в начале этого протокола и сохранение стерильности на протяжении всей процедуры имеют решающее значение. После сбора образцов могут быть выполнены стандартные методы экспрессии белка генома. Этот метод помогает лучше понять влияние электрических и/или механических стимулов клеток.
До недавнего времени было невозможно использовать одно и то же устройство для стимуляции, что затруднять сравнение результатов.
