يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للاستنساخ لتنقية واستزراع أنواع محددة من الخلايا العصبية الأولية. هذه الثقافات هي مناسبة للتحليل الكهربائي الفيزيولوجي والتشكلي والبقاء على قيد الحياة. يمكن استخدام ثقافات الخلايا العصبية النقية لدراسة أساسيات علم وظائف الأعضاء العصبية ، وتشكيل نقاط الاشتباك العصبي وكذلك كيفية تطوير الشبكات العصبية.
بينما نحن نركز على الخلايا الرئيسية الغلوتاماترجية القشرية وجابارجيورونس, هذا الإجراء يمكن تعديلها بسهولة لدراسة أي خطوط الخلايا العصبية التي تعبر عن البروتينات الفلورية. لإعداد أغطية الزجاج، أولا ذوبان aliquot خمسة ملليلتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر حل PLL. تخفيف هذا المحلل المخزون إلى 20 ميكروغرام لكل ملليلتر عن طريق إضافة 45 ملليلتر من حقن نقية الصف المياه.
ثم تصفية تعقيم الحل في أنبوب جديد مخروطي 50 ملليلتر وتسمية هذا الأنبوب كما PLL معقم. المقبل، مكان 100 معقمة جولة 12 ملليمتر الزجاج أغطية في حل PLL العقيمة. تهيج الأنبوب كل خمس إلى 10 دقائق لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان حتى الطلاء.
بعد 40 دقيقة من طلاء PLL ، خذ قطعتين من ورق الأنسجة ووضعها مسطحة في خزانة التدفق. تعقيم الورق باستخدام 70٪ الإيثانول ثم تسطيح لإزالة التجاعيد وتترك لتجف. بعد طلاء الزجاج يغطي لمدة ساعة واحدة مع PLL، وإزالة فائض محلول PLL وإضافة حقن معقمة حقن المياه الصف.
يهيج برفق الأغطية لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان لإزالة PLL الزائدة. كرر هذه الخطوة الشطف مرتين أكثر من ذلك. إزالة المياه الزائدة ومن ثم نقل الأغطية إلى ورق الأنسجة العقيمة.
مرة واحدة الجافة، ونقل الأغطية إلى لوحة ثقافة 24 جيدا. لإعداد حلول ثقافة الخلية، قياس 12 ملليلتر من الخلية العازلة لثقافة إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وتسمية كـ BSA. قياس من أصل خمسة ملليلتر من الخلية العازلة ثقافة مختلفة 15 ملليلتر أنبوب وتسمية papain.
في وقت لاحق، احتضان كلا الأنابيب لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية. إضافة 120 ملليغرام من BSA إلى أنبوب المسمى BSA. ثم عكس أنبوب للمساعدة في حل الحل.
ثم إضافة سبعة ملليغرام من papain إلى أنبوب المسمى papain. أعيدي كلا الأنابيب إلى حمام الماء لمدة 15 دقيقة. تصفية تعقيم حل BSA في أنبوب مخروطية جديدة.
تقسيم محلول BSA العقيمة إلى ثلاثة أنابيب وتسمية كل أنبوب كما BSA العقيمة وإما واحد أو اثنين أو ثلاثة. تصفية الآن تعقيم أنبوب papain وتسمية الأنبوب كما papain معقمة. عودة جميع الأنابيب مرة أخرى إلى حمام الماء والاستمرار في احتضان في 37 درجة مئوية حتى الاستخدام.
للتحضير لتشريح الأنسجة ، وضع المشرط والمقص والملقط والملعقة اللازمة لتشريح قرن آمون والقشرة. ضع طبقين من 35 ملليمترًا من الأطباق بيترية وطبق بيتري عيار 100 ملليمتر يحتوي على ورق فلتر معقمة في خزانة التدفق. جمع NexCre المعدلة وراثيا؛ Ai9 أو الفينة GABA الناقل فينوس الجراء الماوس التي سيتم تشريحها باستخدام مصباح الفلورسنت مع الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات التمييز الجراء الفلورسنت من أنواع البرية لتر الاصحاب.
مباشرة قبل تشريح الحيوانات، وملء في كل طبق بيتري مع المبردة العازلة خلية عقيمة الثقافة. بعد تشريح، نقل بعناية الدماغ الجرو المعدلة وراثيا إلى ورقة مرشح العقيمة. أولاً، تشريح المخيخ وفصل نصفي الكرة الأرضية.
ثم فصل بعناية الحصين والقشرة من كل نصف الكرة الأرضية. نقل الأنسجة تشريح إلى 35 ملليمتر طبق بيتري التي تحتوي على خلية المبردة العازلة الثقافة. ثم نقل قرن آمون تشريح والقشرة إلى غطاء آخر 35 ملليمتر بتري طبق.
باستخدام الحافة المسطحة من شفرة مشرط، ختم بعناية الأنسجة في حركة متقاطع حتى تبقى قطع صغيرة فقط. بعد ذلك، نقل الأنسجة المفرومة مع كمية صغيرة من محلول البابين من غطاء طبق بيتري إلى أنبوب باباين العقيمة. احتضان الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
بعد حضانة باباين، نقل أنبوب باباين العقيمة وأنبوب BSA العقيمة إلى مجلس الوزراء تدفق. ثم استخدام ماصة باستور ملليلتر واحد لنقل فقط أنسجة كورتيكوهيبابوكامبال من أنبوب باباين في أنبوب BSA واحد. من أجل تفريق أي كتل كبيرة من الأنسجة، triturate الأنسجة عدة مرات باستخدام ماصات باستور ملليلتر واحد.
بعد هذا، triturate الأنسجة سبع مرات باستخدام غرامة تلميح الماص باستور. بعد 30 ثانية، نقل ملليلتر واحد من المحلل السفلي والأنسجة من أنبوب BSA واحد إلى أنبوب BSA اثنين. Triturate الأنسجة في أنبوب BSA مرتين عدة مرات باستخدام غرامة تلميح الماص باستور.
بعد التثغر، نقل ملليلتر واحد من الأنسجة السفلية والحل من أنبوب BSA واحد إلى أنبوب BSA ثلاثة. اِثُل الأنسجة في أنبوب BSA ثلاث مرات. بعد التثفير، نقل جميع الحل والأنسجة من أنابيب اثنين وثلاثة إلى أنبوب BSA واحد.
Triturate مرتين إلى ثلاث مرات أخرى والطرد المركزي في 3،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية سوبرنات من الأنسجة بيليه وإعادة تعليق الخلايا باستخدام ماصة P1000 في مليلتر اثنين من السبات كاملة متوسطة الفلورانس منخفضة. ثم triturate الأنسجة 20 مرات لضمان إعادة ينسر كاملة من حل الأنسجة.
في وقت لاحق، filer تعليق الخلية من خلال منخل خلية 30 ميكرومتر في أنبوب عينة البوليسترين. إعداد أنابيب جمع فرز الخلايا عن طريق pipetting 300 microliters من السبات كاملة وسائط إلى العدد المطلوب من أنابيب البولي بروبلين. لكل نوع خلية فلورية ليتم فرزها، اختر الإثارة المناسبة ومرشحات الانبعاثات.
اثير بروتين الزهرة باستخدام 488 نانومتر الموجة الكشف عن الضوء المنبعث من خلال 530/40 مرشح الانبعاثات مجموعة. اثير بروتين TdTomato باستخدام 531 نانومتر الموجة والكشف عن الضوء المنبعث من خلال 575/30 مجموعة مرشح الانبعاثات. للحصول على نقاء عالي، قم بفرز الخلايا الفلورية ذات التسمية الزاهية.
بعد فرز الخلايا، نقل الخلايا التي تم جمعها إلى اثنين ملليلتر جولة أنابيب الطرد المركزي القاع. ثم الطرد المركزي الخلايا في 3،000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق لتشكيل بيليه الخلية. Resuspend بيليه الخلية في المبلغ المطلوب من ما قبل الدافئة كاملة الدوري الاميركي للمحترفين المتوسطة لتحقيق كثافة الخلية من 1، 000 خلية لكل ميكرولتر.
لتأكيد وجود خلايا منفصلة، تحقق من محلول الخلية تحت المجهر باستخدام 4X أو عدسة هدف 10X. قبل طلاء الخلايا، دوامة بسرعة متوسطة لمدة 2-3 ثوان لضمان تعليق الخلية حتى. بعد دوامة، الماصات بسرعة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مركز كل غطاء.
بعد ساعة واحدة، تغذية الخلايا مع 500 ميكرولترات من ما قبل الدافئة كاملة الدوري الاميركي للمحترفين المتوسطة والعودة إلى الحاضنة في 37 درجة مئوية. للمشاركة في زراعة الخلايا العصبية النقية والخلايا الدبقية، مرور الخلايا الدبقية إلى العدد المطلوب من الخلايا ثقافة إدراج. ويتم ذلك عن طريق طلاء 40، 000 الخلايا الدبقية في 500 ميكرولتر قطرات من المتوسط الدوري الاميركي للمحترفين كاملة.
بعد ساعة واحدة، نقل تدرج ثقافة الخلية الدبقية إلى الخلايا العصبية النقية. إزالة وسائل الإعلام الزائدة من إدراج الثقافة وإعادة لوحات إلى الحاضنة لاستزراع. بعد الفرز الناجح، يجب أن تظهر الخلايا العصبية مطلي جولة في الشكل مع غشاء أملس وينبغي أن ينظر إليها لتجنيب ما يصل neuroids بعد ما يقرب من ساعة واحدة في المختبر.
سبعة أيام في المختبر، على الرغم من أن بعض الموت الخلية قد تكون واضحة، ينبغي أن تكون خلايا قابلة للحياة موجودة في جميع ظروف الثقافة. تحليل الثقافات النقية يكشف أن كلا من الجلوتاطة والخلايا العصبية GABAergic كانت قادرة على تمديد محاور المحاور والتشعبات من أجسامها الخلية والاحتفاظ بالقدرة على توليد إمكانات العمل استجابة لعتبة فائقة الحقن الحالية. لا سيما بعد تنقية, تلقى فقط الخلايا العصبية GABAergic كمية كبيرة من انتقال متشابك عفوية والخلايا العصبية الجلوتاطة الغلوتامية تلقى القليل جدا من انتقال متشابك في غياب الخلايا الدبقية.
الأهم من ذلك, زراعة الخلايا العصبية النقية مع الخلايا الدبقية يحسن نمو الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة، فضلا عن تعزيز انتقال متشابك في الثقافات الجلوتاتية. يكفي طلاء الاستقطاب من الأغطية والحفاظ على pH الفسيولوجية من وسائل الإعلام الثقافة في جميع أنحاء الإجراء هي المفتاح لضمان ثقافات الخلايا ذات نوعية جيدة. بعد هذا البروتوكول، ينبغي أن يكون من الممكن إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي ومطياف كتلة البروتين على الثقافات النقية مما يسمح لعمليات الترجمة والنسخي أن يتم التحقيق في أنواع خلايا عصبية محددة.
