Este protocolo describe un método simple y reproducible para purificar y cultivar tipos específicos de neurona primaria. Estos cultivos son adecuados para el análisis electrofisiológico, morfológico y de supervivencia. Los cultivos de las neuronas purificadas se pueden utilizar para estudiar los fundamentos de la fisiología neuronal, la formación de sinapsis, así como cómo se desarrollan las redes neuronales.
Mientras nos centramos en las células principales glutamatérgicas corticales e interneurones GABAérgicos, este procedimiento se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier línea neuronal que exprese proteínas fluorescentes. Para preparar los cubreobjetos de vidrio, primero descongele una alícuota de cinco mililitros de 200 microgramos por mililitro solución PLL. Diluir esta solución en stock a 20 microgramos por mililitro añadiendo 45 mililitros de agua pura de grado de inyección.
A continuación, filtre la solución en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y etiquete este tubo como estéril PLL. A continuación, coloque 100 cubreobjetos de vidrio redondos estériles de 12 milímetros en la solución estéril de PLL. Agitar el tubo cada cinco a 10 minutos durante dos a tres minutos para asegurar un recubrimiento uniforme.
Después de 40 minutos de recubrimiento PLL, tome dos trozos de papel tisú y pégalos planos en el armario de flujo. Esterilice el papel con 70%etanol y luego aplanar para eliminar los pliegues y dejar secar. Después de recubrir los cubreobjetos de vidrio durante una hora con PLL, retire el exceso de solución de PLL y agregue agua estéril de grado de inyección.
Agitar suavemente los cubreobjetos durante dos o tres segundos para eliminar el exceso de PLL. Repita este paso de enjuague dos veces más. Retire el exceso de agua y luego transfiera los cubreobjetos al papel de tejido estéril.
Una vez seco, transfiera los cubreobjetos a una placa de cultivo de 24 pozos. Para preparar las soluciones de cultivo celular, mida 12 mililitros de búfer de cultivo celular a un tubo cónico de 15 mililitros y etiquete como BSA. Mida cinco mililitros de tampón de cultivo celular a un tubo diferente de 15 mililitros y etiquete como papaína.
Posteriormente, incubar ambos tubos durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Añadir 120 miligramos de BSA al tubo etiquetado como BSA. A continuación, invierta el tubo para ayudar a disolver la solución.
Luego agregue siete miligramos de papaína al tubo etiquetado papaína. Vuelva a colocar ambos tubos en el baño de agua durante 15 minutos. Filtrar esterilizar la solución BSA en un tubo cónico fresco.
Divida la solución estéril de BSA en tres tubos y etiquete cada tubo como estéril BSA y uno, dos o tres. Ahora filtre el tubo de papaína y etiquete el tubo como papaína estéril. Devuelva todos los tubos al baño de agua y continúe incubando a 37 grados centígrados hasta su uso.
Para prepararse para la disección de tejidos, ex cabo el bisturí, las tijeras, los fórceps y la espátula necesarios para la disección del hipocampo y la corteza. Coloque dos platos Petri de 35 milímetros y un plato Petri de 100 milímetros que contenga papel de filtro estéril en el armario de flujo. Recoger NexCre transgénico; Ai9 o vesicular GABA transportador Venus cachorros de ratón que deben ser diseccionados utilizando una lámpara fluorescente con filtros de excitación y emisión adecuados para discriminar cachorros fluorescentes de mates de litros de tipo salvaje.
Inmediatamente antes de diseccionar los animales, rellene cada plato de Petri con tampón de cultivo celular estéril refrigerado. Después de la disección, transfiera cuidadosamente el cerebro del cachorro transgénico a un papel de filtro estéril. Primero, disecciona el cerebelo y separa los dos hemisferios.
Luego separa cuidadosamente el hipocampo y la corteza de cada hemisferio. Transfiera el tejido diseccionado a una placa Petri de 35 milímetros que contenga tampón de cultivo celular refrigerado. Luego transfiera el hipocampo diseccionado y la corteza a la tapa de otra placa Petri de 35 milímetros.
Usando el borde plano de una cuchilla de bisturí, corta cuidadosamente el tejido en un movimiento entrecruzado hasta que solo queden trozos pequeños. A continuación, transfiera el tejido picado con una pequeña cantidad de solución de papaína desde la tapa de la placa de Petri al tubo de papaína estéril. Incubar el tejido a 37 grados centígrados durante 25 minutos.
Después de la incubación de papaína, transfiera el tubo de papaína estéril y los tubos estériles BSA al armario de flujo. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de un mililitro para transferir solo el tejido corticohippocampal del tubo de papaína al tubo BSA uno. Con el fin de romper cualquier gran grupo de tejido, triturar el tejido varias veces utilizando una pipeta Pasteur de un mililitro.
Después de esto, triturar el tejido siete veces usando una pipeta Pasteur punta fina. Después de 30 segundos, transfiera un mililitro de la solución inferior y el tejido del tubo BSA uno al tubo BSA dos. Triturar el tejido en el tubo BSA dos veces utilizando una pipeta Pasteur punta fina.
Después de la trituración, transfiera un mililitro del tejido inferior y la solución del tubo BSA uno al tubo BSA tres. Triturar el tejido en el tubo BSA tres veces. Después de la trituración, transfiera toda la solución y el tejido de los tubos dos y tres al tubo BSA uno.
Triturar de dos a tres veces más y centrifugar a 3.000 veces g durante tres minutos. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante del tejido peletizador y resuspender las células utilizando una pipeta P1000 en dos mililitros de hibernación completa Un medio de baja fluorescencia. Luego tritura el tejido 20 veces para asegurar la resuspensión completa de la solución tisular.
Posteriormente, archiva la suspensión celular a través de un tamiz celular de 30 micrómetros en un tubo de muestra de poliestireno. Preparar los tubos de recogida de clasificación celular pipeteando 300 microlitros de medios de hibernación completoS al número requerido de tubos de polipropileno. Para cada tipo de celda fluorescente que se va a ordenar, elija los filtros de excitación y emisión adecuados.
Excite la proteína Venus utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros y detecta la luz emitida a través del conjunto de filtros de emisión 530/40. Excite la proteína TdTomato utilizando una longitud de onda de excitación de 531 nanómetros y detecte la luz emitida a través del conjunto de filtros de emisión 575/30. Para una alta pureza, clasifille las células fluorescentes con la etiqueta brillante.
Después de la clasificación celular, transfiera las células recogidas a dos tubos de centrífuga inferior redonda de mililitro. Luego centrifugar las células a 3.000 veces g durante tres minutos para formar un pellet celular. Resuspender el pellet celular en la cantidad necesaria de medio NBA completo precale calentado para lograr una densidad celular de 1.000 células por microlitro.
Para confirmar la presencia de células disociadas, compruebe la solución celular bajo un microscopio utilizando una lente objetivo 4X o 10X. Antes de enchapar las células, vórtice a una velocidad media durante dos a tres segundos para asegurar una suspensión de células uniforme. Después del vórtice, pipetee rápidamente 10 microlitros de la suspensión celular al centro de cada cubrelip.
Después de una hora, alimenta las células con 500 microlitros de medio NBA completo precalentó y regresa a la incubadora a 37 grados centígrados. Para co-cultivar las neuronas purificadas y las células gliales, pasar las células gliales al número requerido de inserciones de cultivo celular. Esto se hace enchacando 40.000 células gliales en una gota de 500 microlitros de medio completo de la NBA.
Después de una hora, transferir inserciones de cultivo de células gliales a neuronas purificadas. Retire el exceso de medios de las plaquitas de cultivo y devuelva las placas a la incubadora para su cultivo. Después de la clasificación exitosa, las neuronas chapadas deben aparecer redondas en forma con una membrana lisa y deben ser vistos para ahorrar neuroides después de aproximadamente una hora in vitro.
Durante siete días in vitro, aunque algunas muertes celulares pueden ser evidentes, las células viables deben estar presentes en todas las condiciones del cultivo. El análisis de cultivos purificados revela que tanto las neuronas glutamatérgicas como las GABAérgicas fueron capaces de extender axones y dendritas de sus cuerpos celulares y retener la capacidad de generar potenciales de acción en respuesta a las inyecciones actuales despolarizantes súper umbral. En particular después de la purificación, sólo las neuronas GABAérgicas recibieron una cantidad significativa de transmisión sináptica espontánea y las neuronas glutamatérgicas recibieron muy poca transmisión sináptica en ausencia de células gliales.
Es importante destacar que el cultivo de neuronas purificadas con células gliales mejora el crecimiento y la supervivencia de las neuronas, así como promover la transmisión sináptica en cultivos glutamatérgicos. Suficiente recubrimiento polarizador de los cubreobjetos y el mantenimiento del pH fisiológico de los medios de cultivo durante todo el procedimiento son clave para garantizar cultivos celulares de buena calidad. Siguiendo este protocolo, debe ser posible realizar la secuenciación del ARN y la espectroscopia de masa proteica en cultivos purificados que permitan investigar los procesos traslacionales y transcripcionales en tipos neuronales específicos.
