Этот протокол описывает простой и воспроизводимый метод очистки и культивирования конкретных типов первичных нейронов. Эти культуры подходят для электрофизиологического, морфологического и анализа выживаемости. Культуры очищенных нейронов могут быть использованы для изучения основ нейронной физиологии, формирования синапсов, а также того, как развиваются нейронные сети.
В то время как мы фокусируемся на корковых глутаматергических основных клетках и ГАМК-интернейронах, эта процедура может быть легко изменена для изучения любых нейронных линий, выражаюющих флуоресцентные белки. Для подготовки стеклянных обложек сначала размораживается пятимиллилитровая алицита 200 микрограмм на миллилитр PLL раствора. Разбавить этот запас раствор до 20 микрограмм на миллилитр, добавив 45 миллилитров чистой воды инъекционного класса.
Затем фильтр стерилизовать раствор в новую 50 миллилитров конической трубки и этикетки этой трубки, как PLL стерильной. Далее поместите 100 стерильных круглых 12-миллиметровых стеклянных крышек в стерильный раствор PLL. Агитировать трубку каждые пять-десять минут в течение двух-трех минут, чтобы обеспечить равномерное покрытие.
После 40 минут покрытия PLL, возьмите два куска бумаги и положите их плашмя в шкаф потока. Стерилизовать бумагу с помощью 70%этанола затем сгладить, чтобы удалить складки и оставить высохнуть. После покрытия стеклянные крышки в течение одного часа с PLL, удалить избыток раствора PLL и добавить стерильные инъекции класса воды.
Аккуратно агитировать крышки в течение двух-трех секунд, чтобы удалить избыток PLL. Повторите этот полоскающий шаг еще два раза. Удалите излишки воды, а затем перенесите крышки на стерильную бумагу.
После высыхания, передача coverslips на 24 хорошо культуры пластины. Чтобы подготовить решения клеточной культуры, измерьте 12 миллилитров буфера клеточной культуры до 15 миллилитров конической трубки и этикетки как BSA. Измерьте пять миллилитров буфера клеточной культуры до другой 15-миллилитровой трубки и этикетки как папаин.
Впоследствии инкубировать обе трубки в течение 15 минут при 37 градусах по Цельсию. Добавьте 120 миллиграммов BSA в трубку с маркировкой BSA. Затем инвертировать трубку, чтобы помочь растворить раствор.
Затем добавьте семь миллиграммов папаина в трубку с маркировкой папаин. Вернуть обе трубки на водяную баню в течение 15 минут. Фильтр стерилизовать раствор BSA в свежую коническую трубку.
Разделите стерильный раствор BSA на три трубки и помечат каждую трубку как стерильную и одну, две или три. Теперь фильтр стерилизовать папаин трубки и этикетки трубки, как папаин стерильным. Вернуть все трубки обратно в ванну для воды и продолжать инкубировать при 37 градусов по Цельсию до использования.
Чтобы подготовиться к вскрытию тканей, выложить скальпель, ножницы, типсы и шпатель, необходимые для вскрытия гиппокампа и коры головного мозга. Поместите две 35-миллиметровые чашки Петри и 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую стерильную фильтровальную бумагу, в шкаф потока. Сбор трансгенных NexCre; Ai9 или vesicular ГАМК транспортер Венера мыши щенков, которые должны быть вскрыты с помощью флуоресцентной лампы с соответствующим возбуждением и выбросов фильтров для дискриминации флуоресцентных щенков от диких типа литровых товарищей.
Непосредственно перед вскрытием животных заполните каждую чашку Петри охлажденным стерильным буфером культуры клеток. После вскрытия тщательно перенесите мозг трансгенного щенка в стерильную фильтровальную бумагу. Во-первых, вскрыть мозжечок и отделить два полушария.
Затем тщательно отделить гиппокамп и кору от каждого полушария. Перенесите расчлененную ткань на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую буфер охлажденной клеточной культуры. Затем перенесите расчлененный гиппокамп и кору на крышку еще 35-миллиметровой чашки Петри.
Используя плоский край лезвия скальпеля, тщательно нарезать ткани в движении крест, пока только мелкие кусочки остаются. Затем перенесите нарезанную ткань с небольшим количеством раствора папаина из крышки чашки Петри в стерильную трубку папаина. Инкубировать ткань при 37 градусах по Цельсию в течение 25 минут.
После инкубации папаина перенесите стерильную папиновую трубку и стерильные трубки BSA в шкаф потока. Затем используйте один миллилитр Пастер пипетки для передачи только кортикогиппокампальной ткани из папинной трубки в трубку BSA один. Для того, чтобы разбить любые большие скопления тканей, тритурировать ткани несколько раз с помощью одного миллилитров Пастер пипетки.
После этого, тритурировать ткани семь раз с помощью тонкой наконечник Пастер пипетки. Через 30 секунд перенесите один миллилитр нижнего раствора и ткани из трубки BSA в две трубки BSA. Тритурировать ткани в трубке BSA два раза с помощью тонкой наконечник Пастер пипетки.
После тритурации перенесите один миллилитр нижней ткани и раствор из трубки BSA в три трубки BSA. Тритурат ткани в трубке BSA три раза. После тритурации перенесите весь раствор и ткани из трубок два и три в трубку BSA один.
Тритурат еще два-три раза и центрифуга по 3000 раз г в течение трех минут. После центрифугации, тщательно удалить супернатант из гранулированной ткани и повторно использовать клетки с помощью P1000 пипетки в двух миллилитров полной спячки низкой флуоресценции среды. Затем тритурировать ткани 20 раз, чтобы обеспечить полное повторное успение раствора ткани.
Впоследствии, филе ячейки подвески через 30 микрометровых клеток сито в полистирол образца трубки. Подготовь трубки для сортировки клеток, засовав 300 микролитров полного спячки А в необходимое количество полипропилевых трубок. Для каждого типа флуоресцентных клеток, которые должны быть отсортированы, выбрать соответствующие возбуждения и выбросов фильтров.
Возбуждайте белок Венеры с помощью длины волны возбуждения 488 нанометров и обнаруживаете испускаемый свет через набор фильтров выбросов 530/40. Возбуждайте белок TdTomato с помощью длины волны возбудителей 531 нанометров и обнаруживаете испускаемый свет через набор фильтров выбросов 575/30. Для высокой чистоты сортируют ярко помеченные флуоресцентные клетки.
После сортировки клеток перенесите собранные клетки в две миллилитровые круглые нижние центрифуги. Затем центрифуга клетки на 3000 раз г в течение трех минут, чтобы сформировать ячейку гранулы. Resuspend ячейки гранулы в необходимом количестве предварительно разогретой полной среды НБА для достижения плотности клеток 1000 клеток на микролитер.
Чтобы подтвердить наличие диссоциированных клеток, проверьте клеточный раствор под микроскопом с помощью объектива 4X или 10X. Перед покрытием клеток, вихрь на средней скорости в течение двух-трех секунд, чтобы обеспечить ую подвеску ячейки. После вихря, быстро pipette 10 микролитров подвески клетки к центру каждого coverslip.
Через час накормите клетки 500 микролитров предварительно разогретой полной среды НБА и вернитесь в инкубатор при 37 градусах по Цельсию. Для совместной культуры очищенных нейронов и глиальных клеток, прохождение глиальных клеток к необходимому количеству вставки клеточной культуры. Это делается путем покрытия 40000 глиальных клеток в 500 микролитров капли полной среды НБА.
Через час перенесите глиальные клеточные культуры вставки на очищенные нейроны. Удалите излишки мультимедиа из культурных вставок и верните пластины в инкубатор для культивирования. После успешной сортировки, по покрытием нейронов должны появиться круглые формы с гладкой мембраной и следует рассматривать, чтобы сэкономить невроидов примерно через час в пробирке.
К семи дням в пробирке, хотя некоторые клетки смерти может быть очевидным, жизнеспособные клетки должны присутствовать во всех условиях культуры. Анализ очищенных культур показывает, что как глутаматергические, так и ГАМК-нейроны смогли расширить аксоны и дендриты из их клеточного тела и сохранить способность генерировать потенциал действия в ответ на супер порог деполяризации текущих инъекций. Примечательно, что после очищения, только ГАМК-нейроны получили значительное количество спонтанной синаптической передачи и глутаматергических нейронов получили очень мало синаптической передачи в отсутствие глиальных клеток.
Важно отметить, что культивирование очищенных нейронов с глиальными клетками улучшает рост и выживание нейронов, а также способствует синаптической передаче в глутаматергических культурах. Достаточно поляризационные покрытия coverslips и поддержания физиологических рН культуры средств массовой информации на протяжении всей процедуры являются ключом к обеспечению хорошего качества клеточных культур. Следуя этому протоколу, должна быть возможность выполнить секвенирование РНК и белковую массовую спектроскопию на очищенных культурах, позволяющую исследуемые в конкретных типах нейронов процессы перевода и транскрипции.
