פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לשחזור לטיהור ולכתה של סוגים מסוימים של נוירון ראשי. תרבויות אלה מתאימות לניתוח אלקטרופיזיולוגי, מורפולוגי והישרדותי. תרבויות של נוירונים מטוהרים ניתן להשתמש כדי ללמוד יסודות של פיזיולוגיה עצבית, היווצרות של סינפסות, כמו גם איך רשתות עצביות לפתח.
בעוד אנו מתמקדים בתאים ראשיים גלוטמטרגיים קליפת המוח ו interneurons GABAergic, הליך זה ניתן לשנות בקלות כדי ללמוד את כל הקווים העצביים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. כדי להכין כיסויי זכוכית, הראשון להפשיר aliquot חמישה מיליליטר של 200 מיקרוגרם לכל פתרון PLL מיליליטר. לדלל פתרון מלאי זה 20 מיקרוגרם למיליליטר על ידי הוספת 45 מיליליטר של מים כיתה הזרקה טהורה.
ואז לסנן לעקר את הפתרון לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר ולתייג את הצינור הזה כמו PLL סטרילי. לאחר מכן, מניחים 100 כיסויי זכוכית סטריליים עגולים 12 מילימטר בתתברית PLL סטרילית. להתסיס את הצינור כל חמש עד 10 דקות במשך שתיים עד שלוש דקות כדי להבטיח אפילו ציפוי.
לאחר 40 דקות של ציפוי PLL, לקחת שתי חתיכות של נייר טישו ולהניח אותם שטוחים בארון הזרימה. לעקר את הנייר באמצעות 70%אתנול ואז לשטח כדי להסיר קמטים ולהשאיר להתייבש. לאחר ציפוי כיסויי הזכוכית במשך שעה אחת עם PLL, להסיר פתרון PLL עודף ולהוסיף מים כיתה הזרקה סטרילית.
התסיס בעדינות את הכיסויים למשך שתיים עד שלוש שניות כדי להסיר PLL עודף. חזור על שלב שטיפה זה פעמיים נוספות. הסר מים עודפים ולאחר מכן להעביר את הכיסויים לנייר טישו סטרילי.
לאחר התייבשות, מעבירים את הכיסויים לצלחת תרבות של 24 בארות. כדי להכין את פתרונות תרבות התא, למדוד את 12 מיליליטר של מאגר תרבות התא לצינור חרוט 15 מיליליטר תווית כמו BSA. למדוד את חמישה מיליליטר של חיץ תאים לצינור 15 מיליליטר שונה תווית כמו פפאין.
לאחר מכן, דגירה שני הצינורות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 120 מיליגרם של BSA לצינור שכותרתו BSA. ואז להפוך את הצינור כדי לעזור להמיס את הפתרון.
ואז להוסיף שבעה מיליגרם של פפאין לצינור שכותרתו פפאין. מחזירים את שני הצינורות לאמבט המים למשך 15 דקות. מסנן לעקר את פתרון BSA לתוך צינור חרוט טרי.
חלק את פתרון ה- BSA הסטרילי לשלושה צינורות ותייג כל צינור כסטרילי של BSA ואחד, שניים או שלושה. עכשיו לסנן לעקר את צינור פפאין ולתייג את הצינור כמו פפאין סטרילי. מחזירים את כל הצינורות לאמבט המים וממשיכים להתהגר ב-37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
כדי להתכונן לנתח רקמות, הניחו את האזמל, המספריים, המדפים והמתילה הדרושים לניתוח ההיפוקמפוס וקליפת המוח. מניחים שתי מנות פטרי 35 מילימטר צלחת פטרי 100 מילימטר המכיל נייר מסנן סטרילי בארון הזרימה. לאסוף NexCre מהויר; Ai9 או כלי רכב גאבא טרנספורטר ונוס עכבר גורים כי הם להיות ניתוח באמצעות מנורה פלואורסצנטי עם מסנני קריאה ופלטה מתאימים להפלות גורים פלואורסצנטיים מן בני זוג ליטר סוג בר.
מיד לפני לנתח את בעלי החיים, למלא כל צלחת פטרי עם חיץ תרבות תאים סטריליים מצוננים. לאחר הניתוח, מעבירים בזהירות את מוחו של הגור הטרנסגני לנייר סינון סטרילי. ראשית, לנתח את המוח הקטן ולהפריד בין שתי ההמיספרות.
לאחר מכן הפרד בזהירות את ההיפוקמפוס וקליפת המוח מכל חצי כדור. מעבירים את הרקמה המנותקת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה חיץ תרבות תאים צוננים. לאחר מכן מעבירים את ההיפוקמפוס וקליפת המוח שנותקו למכסה של צלחת פטרי נוספת של 35 מ"מ.
בעזרת הקצה השטוח של להב אזמל, קוצצים בזהירות את הרקמה בתנועה חוצה עד שנותרו רק חלקים קטנים. לאחר מכן, להעביר את הרקמה הקצוצה עם כמות קטנה של פתרון פפאין מן המכסה צלחת פטרי לצינור פפאין סטרילי. דגירה הרקמה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
לאחר דגירה פפאין, להעביר את צינור פפאין סטרילי צינורות BSA סטריליים לארון הזרימה. ואז להשתמש פיפטה פסטר מיליליטר אחד להעביר רק את רקמת קורטיקוהיפוקמפוס מצינור פפאין לתוך הצינור BSA אחד. על מנת לשבור את כל גושים גדולים של רקמה, triturate הרקמה מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר מיליליטר אחד.
לאחר מכן, triturate הרקמה שבע פעמים באמצעות פיפטה פסטר עצה בסדר. לאחר 30 שניות, להעביר מיליליטר אחד של הפתרון התחתון ואת הרקמה מצינור BSA אחד לצינור BSA 2. טריטוראט הרקמה בצינור BSA פעמיים מספר פעמים באמצעות פיפטה פסטר עצה בסדר.
לאחר טריטורציה, להעביר מיליליטר אחד של הרקמה התחתונה פתרון מצינור BSA אחד לצינור BSA שלוש. טריורט את הרקמה בצינור BSA שלוש פעמים. לאחר טריטורציה, להעביר את כל הפתרון ואת הרקמה מצינורות 2 ו -3 לתוך צינור BSA אחד.
טריטוראט פעמיים עד שלוש פעמים נוספות וצנטריפוגה ב 3,000 פעמים g במשך שלוש דקות. לאחר צנטריפוגה, להסיר בזהירות את supernatant מן הרקמה גלולה resuspend התאים באמצעות פיפטה P1000 בשני מיליליטר של שנת חורף מלאה מדיום פלואורסצנטי נמוך. לאחר מכן triturate הרקמה 20 פעמים כדי להבטיח התכווצות מלאה של פתרון הרקמה.
לאחר מכן, filer ההשעיה התא דרך מסמר תא 30 מיקרומטר לתוך צינור מדגם פוליסטירן. הכן צינורות איסוף מיון תאים על ידי צינורות 300 microliters של שינה מלאה מדיה למספר הנדרש של צינורות פוליפרופילן. כדי שכל סוג תא פלואורסצנטי ימוין, בחר את מסנני העירור וההפחתה המתאימים.
לרגש חלבון ונוס באמצעות 488 ננומטר אורך גל העירור ולזהות את האור הנפלט דרך 530/40 מסנן פליטה להגדיר. Excite חלבון TdTomato באמצעות 531 אורך גל העירור ננומטר ולזהות את האור הנפלט דרך 575/30 מסנן פליטה להגדיר. לקבלת טוהר גבוה, מיין תאים פלואורסצנטיים בעלי תווית בהירה.
לאחר מיון התאים, מעבירים את התאים שנאספו לשני צינורות צנטריפוגה עגולים עגולים של שני מיליליטר. ואז צנטריפוגה התאים ב 3, 000 פעמים g במשך שלוש דקות כדי ליצור גלולה תא. תן שימוש חוזר לכדור התא בכמות הנדרשת של מדיום NBA מלא מחומם מראש כדי להשיג צפיפות תאים של 1,000 תאים למיקרוליטר.
כדי לאשר את נוכחותם של תאים דיסוציאציה, בדוק את פתרון התא תחת מיקרוסקופ באמצעות עדשה אובייקטיבית 4X או 10X. לפני ציפוי התאים, מערבולת במהירות בינונית במשך שתיים עד שלוש שניות כדי להבטיח השעיה תא אפילו. בעקבות מערבולת, במהירות pipette 10 microliters של ההשעיה התא למרכז של כל כיסוי.
לאחר שעה, להאכיל את התאים עם 500 microliters של מדיום ה-NBA מלא מחומם מראש ולחזור לחממה ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לתרבת במשותף את הנוירונים המטוהרים ואת תאי הגלישה, מעבר תאים גליה למספר הנדרש של תרבות התא מוסיף. זה נעשה על ידי ציפוי 40, 000 תאי גלייה ב טיפה 500 microliter של מדיום NBA מלא.
לאחר שעה אחת, העברת תרבות תא גליה מוסיף נוירונים מטוהרים. הסר מדיה עודפת מהתוספות התרבותיות והחזר את הצלחות לאינקובטור לצורך פולחן. לאחר מיון מוצלח, נוירונים מצופים צריכים להופיע עגולים בכושר עם קרום חלק ויש לראות כדי לחסוך נוירואידים לאחר כשעה במבחנה.
על ידי שבעה ימים במבחנה, למרות כמה מוות תאי עשוי להיות ברור, תאים קיימא צריך להיות נוכח בכל תנאי התרבות. ניתוח של תרבויות מטוהרות מגלה כי הן נוירונים גלוטמטרגיים ו GABAergic הצליחו להאריך אקסונים ודנדריטים מגופם התא ולשמור על היכולת ליצור פוטנציאל פעולה בתגובה סף סופר depolarizing זריקות הנוכחי. יש לציין כי בעקבות הטיהור, רק תאי עצב GABAergic קיבלו כמות משמעותית של שידור סינפטי ספונטני נוירונים גלוטמטרגיים קיבלו שידור סינפטי מעט מאוד בהיעדר תאים גליה.
חשוב לציין, culturing נוירונים מטוהרים עם תאים גליה משפר את הצמיחה וההישרדות של נוירונים, כמו גם קידום שידור סינפטי בתרבויות גלוטמטרגיות. ציפוי קיטוב מספיק של הכיסויים ושמירה על ה- pH הפיזיולוגי של תקשורת התרבות לאורך כל ההליך הם המפתח להבטחת תרבויות תאים באיכות טובה. בעקבות פרוטוקול זה, זה צריך להיות אפשרי לבצע רצף RNA וספקטרוסקופיה מסה חלבון על תרבויות מטוהרות המאפשר תהליכים תרגום שעתוק להיחקר בסוגים עצביים ספציפיים.
