هناك حاجة لطريقة دقيقة وعالية الإنتاجية لقياس الأجسام المضادة المحايدة للرفاق RSV ، كعلامة مهمة للحماية من فيروس syncytial التنفسي. هذا الأسلوب هو استنساخ للغاية مع الاختلافات بين المقايسة لـ antiserum المرجعية كونها أقل من 10٪ ونحن نعتقد أن هذا الفحص يمكن أن تنشأ بسهولة في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بتكلفة منخفضة نسبيا. نحن نصف هنا اختبار الإبطال الجزئي القائم على التصوير الذي تم اختباره على المجموعة الفرعية A RSV ، ويمكن أيضًا تكييفه مع مجموعة RSV الفرعية B وأنواع عينات مختلفة.
ومن خلال هذا الإجراء، سيكون روبن تسي، عضو فريق البحث في معهد البحوث والتطوير. للوحات البذور في اليوم الأول، أول خلايا A549 resuspend في وسائل الإعلام DMEM، مع 10٪ FCS و 1، 000 وحدة بنسلين-ستريبتوميسين خليط بتركيز 400، 000 خلية لكل ملليلتر. ثم بذور 96-جيدا مسطح القاع لوحات معقمة مع 40، 000 A459 الخلايا بكثافة من 100 ميكرولترات في بئر.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪بين عشية وضحاها. لإعداد تخفيف المصل في اليوم الثاني ، قم أولاً بإذابة الدمن المرجعي RSV وعينات اختبار المصل في درجة حرارة الغرفة. ثم وضعها في حمام مائي في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسخينها وتفعيلها.
المقبل, إعداد أكثر من 110 ميكرولترات من واحد إلى 100 تخفيف المصل المرجعي عن طريق خلط 1.5 ميكرولترات من المصل المرجعي مع وسائل الإعلام DMEM FCS خالية مع خليط البنسلين-ستريبتوميسين إلى حجم النهائي من 150 ميكرولترات. الماصات 110 ميكرولترات من هذا التخفيف إلى A12 جيدا من 96 جيدا يو القاع لوحة معقمة. لجعل المسلسل واحد إلى اثنين من التخفيفات أسفل لوحة، أولا إضافة 55 ميكرولترات من FCS خالية DMEM وسائل الإعلام مع خليط البنسلين-ستريبتوميسين إلى الآبار B12 إلى H12.
ثم مع نقل تلميح جديد 55 ميكرولترات من A12 جيدا إلى B12 جيدا. الماصات صعودا وهبوطا خمس مرات لخلط الحل، وتستمر حتى تصل إلى H12 بشكل جيد. ماصة قبالة 55 ميكرولترات الزائدة من الحل من H12 جيدا.
بعد ذلك، قم بإعداد تخفيف واحد إلى 100 عينة اختبار المصل، وإضافة 110 ميكرولترات من كل تخفيف إلى الآبار المقابلة A1 إلى A9 و E1 إلى E9 من لوحة 96-جيداً. ثم إضافة 55 microliters من FCS خالية DMEM وسائل الإعلام مع خليط البنسلين-ستريبتوميسين إلى الآبار في الأعمدة من واحد إلى تسعة. جعل التسلسلي واحد إلى اثنين من التخفيفات من الصف A إلى الصف D ومن الصف E إلى الصف H كما هو موضح سابقا.
إضافة 55 ميكرولترات من وسائل الإعلام DMEM FCS خالية مع خليط البنسلين-ستريبتومايسين إلى الآبار في العمودين 10 و 11. لإعداد مخزون الفيروس ، وضعت أولا قارورة المجمدة من RSV في حمام الماء 37 درجة مئوية لإذابته بسرعة ، ثم وضع القارورة على الجليد. بعد ذلك، يضاف الفيروس إلى وسائط DMEM التي تحتوي على خليط البنسلين -ستريبتومايسين عند حوالي 200 PFU لكل بئر لصنع حجم إجمالي قدره 55 ملليلتر لـ 100 بئر.
لإعداد خليط مصل الفيروس، أولا إضافة 55 ميكرولترات من الفيروس المخفف إلى جميع الآبار من الأعمدة من واحد إلى تسعة وآبار من الصفوف E إلى H من الأعمدة 10 و 11. ثم إضافة 55 microliters من FCS خالية DMEM وسائل الإعلام مع خليط البنسلين-ستريبتوميسين لجميع الآبار من الصفوف من الألف إلى جانب D من الأعمدة 10 و 11، وتحتضن لوحة في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ساعة واحدة. قبل تلقيح الخلايا A549 مع RSV، فحص لوحة الخلية تحت مجهر الضوء للتأكد من أن الخلايا أحادية الخلايا A549 هي 80٪ التقاء.
ثم عكس لوحة بلطف لتجاهل وسائل الإعلام، ولطخة طفيفة لوحة على منشفة ورقية ماصة العقيمة. بعد كل، وغسل مع برنامج تلفزيوني معقم مفلتر. بعد ذلك إضافة 100 ميكرولترات لكل بئر من خليط مصل الفيروس إلى الآبار المقابلة على لوحة الخلايا A549 وفقا لقالب لوحة المقدمة في المخطوطة، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة، واستخدام ماصة لإزالة 90 ميكرولتررس في البئر، وإضافة 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام التي تحتوي على 1XM199، 1.5٪ CMC، و 2٪ FCS في خليط البنسلين-ستريبتوميسين. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. لإصلاح وتطوير لوحة فحص, عكس أولا لوحة خلية A549 المصابة RSV بلطف لتجاهل وسائل الإعلام التي تحتوي على M199, CMC, 2٪ FCS, والخليط بينيسلين-ستريبتوميسين.
ثم إضافة ببطء 200 ميكروليترس من التخزين المؤقت التثبيت إلى كل بئر. احتضان لوحة في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم تجاهل العازلة التثبيت ولطخة بلطف على منشفة ورقية ماصة.
اتركي وجه الطبق لتجف لمدة 10 دقائق. ثم مع تصفية PBS العازلة التي تحتوي على 05 polysorbate 20، وجعل 5٪ الحليب حظر الحل. أضف 200 ميكرولترات من محلول الحجب لكل بئر ويحضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة عكس لوحة بلطف لتجاهل الحل ولطخة على منشفة ورقية ماصة. لجعل الأجسام المضادة الأولية، وتمييع واحد إلى 500 الماعز XRSV الأجسام المضادة في حل حظر. إضافة 50 ميكروليتر إلى كل بئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
غسل لوحة ثلاث مرات مع فلترة PBS-polysorbate. المقبل, جعل الجسم المضاد الثانوي عن طريق تمييع واحد إلى 5,000 اليكسا فلور حمار المضادة للماعز الغلوبولين المناعي G في حل حجب. إضافة 50 ميكرولترات إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
غسل لوحة خمس مرات مع فلترة PBS-polysorbate. لحساب اللوحات مع قارئ بقع الآلي، استخدم أولا لوحة ثقافة 96-well غير المستخدمة للتعاون مع الصك عن طريق إدخال إعدادات العد في قناة FITC. ثم قراءة لوحة الخلية، والتفاف عليه في احباط، وتخزينها في أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، تحقق من صور الآبار لللوحات الأثرية أو الطبقات الأحادية المعطلة ، واستبعاد الآبار ذات الطبقات الأحادية المعطلة. تم حساب متوسط عدد لويحات آبار التحكم في عدم المصل واستخدامها لتحديد وقف 50٪ إبطال التي من شأنها أن تؤدي إلى تثبيط 50٪ من نشاط الفيروس. تم رسم تخفيف المصل المتبادل على المحور س وعدد اللويحات على المحور ص من الرسم البياني شبه لوغاريتم من خط مرسوم بين نقطتين.
تم تحديد 50٪ تحييد titres من عينات مصل الاختبار الحمراء وتم تحديد تم تحديد الأمصال مع العد مباشرة فوق أو أقل من 50٪ من آبار التحكم في عدم المصل. أدت مقايسات RSVAPRN في اثنين من مجموعات البالغين المختلفة من غامبيا والمتطوعين الأصحاء في ملبورن إلى البالغين الغامبيين الذين لديهم أقل متوسطًا NAB titre مقارنة بلبالغين ملبورن. المصل المرجعي RSV البشري المبين يوضح تباين منخفض جداً مع معامل التباين بنسبة 6.82٪ يمكن تنفيذ هذا الفحص المحسن عالي الإنتاجية للحد من البلاك RSV في العديد من المختبرات، وسوف يدعم جهود التنسيق الدولية لمنظمة الصحة العالمية لمقايسات الأجسام المضادة المحايدة للأجسام المضادة RSV.
وسيكون هذا الأمر حاسماً في تقييم المرشحين الجديدين للقاح RSV في المستقبل.
