ويسمح هذا البروتوكول بتسمية مركّب محدد وإثراء لاحق وتحديد ركائز CK2 الذاتية من عينة بيولوجية معقدة مثل الخلية أو الأنسجة. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نوع الخلية أو الأنسجة. وبالتالي تسهيل، ودراسة CK2 في سياقات بيولوجية مختلفة.
إثبات الإجراء سيكون جون تشوينوفسكي، طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء ، ميكانيكيا عينة الأنسجة أو الخلايا المستزرعة كما هو مبين في بروتوكول النص لجمع ما مجموعه 900 ميكرولترات من العينة. جهاز طرد مركزي في 17، 500 مرة الجاذبية و4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.
ثم، نقل 270 ميكرولترات من عظمى إلى كل من ثلاثة أنابيب 1.7 ملليلتر microcentuge جديدة. إزالة 40 ميكرولترات من كبرى المتبقية لاستخدامها كتحكم في المدخلات، ونقلها إلى أنبوب جديد. ضع كل العينات على الجليد.
أولاً، تسمية كل من الأنابيب عينة ثلاثة كما هو موضح هنا. إلى أنبوب رد فعل كيناز، إضافة 2.7 ميكرولترات من CK2 و 2.7 ميكرولترات من 2.5 ميللي ميللي GTPgammaS. نفض الغبار الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد.
إلى أنبوب GTPgammas فقط، إضافة 2.7 ميكرولترات من 2.5 ملليمولار GTPgammaS، و 2.7 ميكرولترات من Lysis العازلة. نفض الغبار هذا الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد. إلى أنبوب PNBM فقط إضافة 5.4 ميكرولترات من Lysis العازلة.
نفض الغبار الأنبوب لخلط، وعلى الفور وضعه على الجليد. احتضان جميع الأنابيب الثلاثة في حمام مائي في 30 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد هذا، إضافة 13.5 ميكرولترات من PNBM في 12 ملليغرام لكل ملليلتر إلى كل أنبوب.
عكس الأنابيب لخلط العينات، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. أثناء أخذ العينات، تسمية كل من الأعمدة للعينة ليتم تحميلها، كما هو موضح هنا. إعداد الأعمدة عن طريق عكس كل عمود عدة مرات لإعادة تعليق الراتنج سيخاديكس G-25 في المخزن العازلة.
نعلق كل عمود إلى موقف المشبك، والسماح لها الجلوس دون عائق لمدة خمس دقائق تقريبا للسماح للراتنج تسوية. بعد ذلك، ضع أنبوبًا أسفل الفتح السفلي لكل عمود. إزالة القبعات من كل من أعلى وأسفل كل عمود، للسماح المخزن العازلة لاستنزاف في الأنابيب عن طريق الجاذبية.
بمجرد استنفاد المخزن المؤقت، إضافة حوالي 2.7 ملليلتر من Lysis المخزن المؤقت إلى كل عمود لتكبيل لهم، مع التأكد من جمع وتجاهل تدفق من خلال. كرر هذه العملية لإضافة Lysis Buffer وتجاهل التدفق من خلال ثلاث مرات. للبدء، قم بتحميل كل عينة في عمودها الخاص.
جمع والتخلص من تدفق من خلال. إضافة 420 ميكرولترات من Lysis العازلة إلى كل عمود لغسل العينات. السماح لتصفية Lysis المخزن المؤقت خلال العمود، وجمع وتجاهل تدفق من خلال.
ثم، ضع الأنابيب في موضع تحت كل عمود لجمع العينات. إضافة 500 ميكرولترات من Lysis العازلة لكل عمود ل elute العينات. جمع من خلال تدفق، والذي يحتوي الآن على عدد من السكان المخصب من thiophosphorylated و CKKYLATed ركائز في رد فعل كيناز.
وGGTPgammas رد الفعل فقط سوف تحتوي على ركائز thiophosphorylated و alkylated من قبل أي CK2 الحالية الذاتية. فإن رد فعل PNMB فقط تحتوي على البروتينات الألكيلية الخلفية. إزالة 80 ميكروليترس من كل Elution كعينة التحكم الإدخال Elution.
بعد ذلك، تقسيم كل عينة إلى أنبوبين يحتوي كل منها على 200 ميكرولترات. تسمية كل من أنابيب لتكون إما المضادة للثيوفوسفات استر أو المناعية G، كما هو مبين هنا. إضافة 2.8 ميكروغرام من الأجسام المضادة استر المضادة ثوفوسفات إلى كل من أنابيب استر المضادة للثيوفوسفات.
أضف 2.8 ميكروغرام من الأجسام المضادة Isotype Control إلى كل من أنابيب IGG. ثم ضع الأنابيب على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين. خلال آخر 15 دقيقة من الحضانة العينة، واستخدام شفرة حلاقة نظيفة لقطع نهاية من طرف ماصة P200 لزيادة حجم قياس.
مباشرة قبل الاستخدام، دوامة لفترة وجيزة أنبوب التخزين التي تحتوي على الخرز agarose. باستخدام تلميح المقصوص ، نقل 100 ميكرولترات من الخرز الطين في المناعة أنبوب جديد 1.7 ملليلتر microcentrifuge. من المهم أن دوامة الخرز قبل كل نقل لمنع الخرز من الاستقرار.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 17، 500 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. إزالة وتجاهل ناظر. Resuspend الخرز عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من Lysis العازلة ودوامة لفترة وجيزة لخلط.
كرر هذه العملية من الطرد المركزي وغسل الخرز ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي، ضع الخرز على الجليد حتى تصبح جاهزة للشروع. وعندما تنتهي العينات من الاحتضان، فإن الطرد المركزي بها عند الجاذبية 17500 مرة وعند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.
ثم، نقل 200 ميكرولترات من كل عينة إلى الأنابيب التي تحتوي على الخرز غسلها. ضع الأنابيب على دوار عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 17، 500 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.
إزالة 40 ميكرولترات من كل عظمى لحفظها كتحكم في الاستنفاد. إزالة وتجاهل ما تبقى من عظمى، مع الحرص على عدم إزعاج الخرز. غسل العينات عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من Lysis العازلة لكل ودوامة لفترة وجيزة.
جهاز طرد مركزي في 17، 500 مرة الجاذبية وعلى أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من فائقة. كرر هذه عملية الغسل والطرد المركزي ثلاث مرات مع الحرص على عدم إزعاج الخرز. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من 2X عينة العازلة إلى كل عينة تحتوي على الخرز.
بالنسبة لكافة العينات الأخرى، والتي تتضمن عنصر تحكم الإدخال و عناصر التحكم في الإدخال Elution و عناصر التحكم في الاستنفاد، أضف 8 ميكرولترات من المخزن المؤقت 6X Sample. الماصات كل أنبوب صعودا وهبوطا لخلط باستثناء أنابيب تحتوي على الخرز، وتسخين جميع العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق قبل الشروع في SDS-PAGE. لتقييم ما إذا كان المناعة ناجحة، تشغيل 25 إلى 30 ميكرولترات من كل عينة التي تم الاستعفاء من الخرز على هلام بولياكريلاميد منفصلة 12.5٪.
وصمة عار كل هلام مع Coomassie الأزرق لتصور البروتينات المخصب من مراحل مختلفة من البروتوكول التجريبي. باستخدام جديدة، شفرات الحلاقة نظيفة، استخراج بعناية أي عصابات فريدة من نوعها موجودة في رد فعل كيناز المضادة للثيوفوسفات استر IP لين مع جعل علما الأوزان الجزيئية التقريبية. وينبغي استخدام شفرة حلاقة جديدة لكل فرقة فريدة من نوعها.
والأساس الكامن في هذه التقنية هو أن هذه التقنية هي القدرة غير العادية لـ CK2 على استخدام GTP لنقل مجموعة الفوسفوريل. إضافة CK2 هولوينزيم خارجي جنبا إلى جنب مع GTP التناظرية, GTPgammaS, إلى lysate الخلية, النتائج في thiophosphorylation من ركائز CK2 الذاتية. العلاج اللاحق للlysate مع الكهلات كاشف ع-Nitrobenzyl mesylate يولد thiophosphate استر مويتي على هذه البروتينات الركيزة محددة، التي يمكن بعد ذلك أن تكون مناعية باستخدام المضادة استر ثيوفوسفات وتحديدها في نهاية المطاف من قبل قياس الطيف الشامل.
في النتائج الإيجابية التمثيلية الموضحة هنا، نجحت CK2 التابعة، وثيوفوسفوريليشن والألكيل اللاحقة. كما هو متوقع، يتم ملاحظة إشارة استر مضادة للثيوفوسفات المعززة بواسطة النشاف الغربي فقط في الممر الذي يحتوي على رد فعل كيناز الكامل، وليس في GTPgammas فقط وPNMB العينات المعالجة فقط. هلام Coomassie الأزرق الملون من البروتينات المثبطة للمناعة والملمحة ، كما تثبت نتيجة إيجابية.
كما العصابات الفريدة متعددة واضحة فقط في المضادة للثيوفوسفات استر IP لين, التي كان محتضنة lysate مع CK2 exogenous و GTPgammas. ثم يتم استئصال النطاق المميز من الجل وتقديمه لتحديد البروتين بواسطة قياس الطيف الكتلي. بعد هذا الإجراء، يجب التحقق من صحة ركائز CK2 المفترضة التي تم تحديدها بواسطة قياس الطيف الكتلي باستخدام نهج إضافي، مثل الفسفور المعتمد CK2 في قياس كيناز في المختبر القياسي.
