Bu protokol, hücre veya doku lysate gibi karmaşık bir biyolojik örnekten endojen CK2 substratlarının özel etiketleme ve sonraki zenginleştirme ve tanımlanmasına olanak sağlar. Bu yöntem herhangi bir hücre tipine veya dokuya uygulanabilir. Böylece, çeşitli biyolojik bağlamlarda CK2 çalışma kolaylaştırıcı.
Prosedürü gösteren John Chojnowski, benim laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Başlamak için, toplam 900 mikrolitre numune toplamak için metin protokolünde belirtildiği gibi doku örneğini veya kültürlü hücreleri mekanik olarak inceleyin. Santrifüj 17, 500 kat yerçekimi ve üç dakika boyunca dört santigrat derecede.
Daha sonra, supernatant 270 mikrolitre her üç yeni 1.7 mililitre mikrosantrifüj tüpleri aktarın. Giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere kalan supernatant 40 mikrolitre çıkarın ve yeni bir tüp aktarın. Tüm örnekleri buza yerleştirin.
İlk olarak, burada gösterildiği gibi üç örnek tüpün her birini etiketlayın. Kiaz reaksiyon tüpüne 2,7 mikrolitre CK2 ve 2,7 mikrolitre 2,5 milimolar GTPgammaS ekleyin. Karıştırmak için tüp flick ve hemen buz üzerine yerleştirin.
GTPgammaS'a sadece tüp, 2,7 mikrolitre 2,5 milimolar GTPgammaS ve 2,7 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Karıştırmak için bu tüpü flick ve hemen buz üzerine yerleştirin. PNBM sadece tüp Lysis Tampon 5.4 mikrolitre ekleyin.
Karıştırmak için tüp flick ve hemen buz üzerine yerleştirin. Bir dakika için 30 santigrat derece bir su banyosunda her üç tüp kuluçka. Bundan sonra, her tüp için mililitre başına 12 miligram PNBM 13,5 mikrolitre ekleyin.
Örnekleri karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve numuneleri oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Örnekler kuluçkaya yatarken, burada gösterildiği gibi, numunenin yüklenmesi için sütunların her birini etiketleyin. Depolama arabelleğindeki Sephadex G-25 reçinesini yeniden askıya almak için her sütunu birkaç kez ters çevirerek sütunları hazırlayın.
Her sütunu bir kelepçe standına takın ve reçinenin yerleşmesini sağlamak için yaklaşık beş dakika boyunca rahatsız edilmeden bekletin. Ardından, her sütunun alt açılışının altına bir tüp yerleştirin. Depolama arabellesinin yerçekimi tarafından tüplere akmasını sağlamak için, her sütunun hem üstünden hem de altındaki kapakları çıkarın.
Depolama arabelleği tükendikten sonra, her sütuna yaklaşık 2,7 mililitre Lysis Arabelle ekleyin ve akışı topladığından ve atdığından emin olun. Bu Lysis Arabellek ekleme ve akışı üç kez atma işlemini tekrarlayın. Başlamak için, her örneği kendi sütununa yükleyin.
Akışı toplayın ve atın. Örnekleri yıkamak için her sütuna 420 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Lysis Arabelleği sütun üzerinden filtre ve toplamak ve akışı atmak sağlar.
Ardından, örnek toplama için tüpleri her sütunun altına yerleştirin. Örnekleri elemek için her sütuna 500 mikrolitre Lysis Tampon ekleyin. Şimdi kizaz reaksiyonu içinde kiyofosforile ve alkillenmiş CK2 substratları zenginleştirilmiş bir nüfus içeren aracılığıyla akışı toplamak.
GTPgammaS sadece reaksiyon herhangi bir endojen CK2 mevcut tarafından tiyofosforile ve alkillenmiş substratlar içerecektir. PNMB sadece reaksiyon arka plan alkillenmiş proteinler içerecektir. Her Bir Elution Giriş Kontrolü örneği olarak her Birlasyondan 80 mikrolitre çıkarın.
Ardından, her bir örneği 200 mikrolitre içeren iki tüpe bölün. Burada gösterildiği gibi tüplerin her birini anti-tiofosfat ester veya immünglobulin G olarak etiketleyin. Anti-tiophosphate ester tüplerinin her birine 2,8 mikrogram anti-tiofosfat ester antikoru ekleyin.
IGG tüplerinin her birine 2,8 mikrogram Isotip Control antikor ekleyin. Daha sonra tüpleri dört derece santigrat derecede iki saat boyunca bir rotator üzerine yerleştirin. Numune kuluçkasının son 15 dakikası boyunca, gösterge boyutunu artırmak için P200 pipet ucunu kesmek için temiz bir jilet kullanın.
Hemen önce kullanımdan önce, kısaca agarose boncuk içeren depolama tüpü girdap. Kesme pipet ucunu kullanarak, immünopredibaşına boncuk bulamacının 100 mikrolitresini yeni bir 1,7 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Her transferden önce boncukların yerleşmesini önlemek için boncukları girdaplamak önemlidir.
Tüpleri 17, 500 kat yerçekimive dört santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın. Lysis Tampon 200 mikrolitre ekleyerek boncukre askıya ve kısaca karıştırmak için girdap.
Bu santrifüj işlemini üç kez tekrarlayın ve boncukları yıkanın. Son yıkamadan sonra, devam etmeye hazır olana kadar buz üzerine boncuk yerleştirin. Örnekler kuluçkaya yatıldığında, onları 17, 500 kat yerçekimi ve dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin.
Daha sonra, her numunenin 200 mikrolitresini yıkanmış boncukları içeren tüplere aktarın. Tüpleri bir saat boyunca dört derece santigrat derecede bir rotator üzerine yerleştirin. Sonra, tüpleri 17, 500 kat yerçekiminde ve dört santigrat derecede bir dakika santrifüj edin.
Tükenme kontrolü olarak kaydetmek için her supernatant 40 mikrolitre çıkarın. Boncukları rahatsız etmemeye dikkat edin, supernatant'ın geri kalanını çıkarın ve atın. Örnekleri her birine 200 mikrolitre Lysis Tampon ekleyerek ve kısa bir süre girdap yaparak yıkayın.
17, 500 kat yerçekimi ve bir dakika için dört santigrat derece, supernatant atarak santrifüj. Bu yıkama ve santrifüj işlemini boncukları rahatsız etmemeye özen alarak üç kez tekrarlayın. Bundan sonra, boncuk içeren her örneğe 50 mikrolitre 2X numune arabelleği ekleyin.
Giriş Kontrolü, Elütion Giriş Kontrolleri ve Tükenme Kontrolleri dahil olmak üzere diğer tüm örnekler için, 6X Örnek Arabellek 8 mikrolitre ekleyin. Pipet her tüp yukarı ve aşağı boncuk içeren tüpler dışında karıştırmak için, ve SDS-PAGE ile devam etmeden önce beş dakika boyunca 95 santigrat derece tüm örnekleri ısıtın. İmmünenyağış başarılı olup olmadığını değerlendirmek için, ayrı bir% 12.5 poliakrilamid jel üzerinde boncuklar kaçan her örnek 25-30 mikrolitre çalıştırın.
Deneysel protokolün çeşitli aşamalarından zenginleştirilmiş proteinleri görselleştirmek için her jeli Coomassie Blue ile lekeleyin. Yeni, temiz jiletler kullanarak, yaklaşık molekül ağırlıklarını not alırken kizreaksiyonanti-tiyosfat ester IP Lane mevcut herhangi bir benzersiz bantları dikkatle çıkarmak. Her benzersiz bant için yeni bir jilet kullanılmalıdır.
Bu tekniğin altında yatan temel, CK2'nin fosforlu grup transferi için GTP'yi kullanabilmesidir. GTP analogu GTPgammaS ile birlikte eksojen CK2 holoenziminin hücre lysate'sine eklenmesi, endojen CK2 substratlarının tiyofosforilasyonla sonuçlanır. Alkilleyici reaktif p-Nitrobenzyl mesylate ile lysate sonraki tedavi bu özel substrat proteinlerüzerinde tiyofosfat ester moiety oluşturur, daha sonra bir anti-tiyofosfat ester antikor kullanılarak immünpresipite edilebilir ve sonuçta Kütle spektrometresi ile tespit.
Burada gösterilen temsili olumlu sonuçlarda CK2 bağımlı, tiyofosforilasyon ve müteakip alkilasyon başarılı oldu. Beklendiği gibi, Batı lekeleme tarafından geliştirilmiş bir anti-tiyofosfat ester sinyali sadece tam kiyaz reaksiyonu içeren şeritte gözlenir, sadece GTPgammaS ve PNMB sadece tedavi örnekleri nde değil. Bir Coomassie Mavi lekeli jel immünopsipitated ve ima proteinler, ayrıca olumlu bir sonuç göstermektedir.
Birden fazla benzersiz bantlar sadece anti-tiyofosfat ester IP Lane belirgin olduğu gibi, hangi lysate eksojen CK2 ve GTPgammaS ile kuluçka yada oldu. İşaretli bant daha sonra jelden çıkarılarak kütle spektrometresi ile protein tanımlaması için gönderilir. Bu prosedürü takiben, kütle spektrometresi ile tanımlanan putatif CK2 substratları, standart in vitro kisaz testinde CK2'ye bağımlı fosforilasyon gibi ek bir yaklaşımla doğrulanmalıdır.
