Este protocolo permite el etiquetado específico y el posterior enriquecimiento e identificación de sustratos endógenos de CK2 a partir de una muestra biológica compleja como un izado celular o tisular. Este método se puede aplicar a cualquier tipo de célula o tejido. Facilitando así, el estudio de CK2 en diversos contextos biológicos.
Demostrando el procedimiento estará John Chojnowski, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para comenzar, lice la muestra de tejido o las células cultivadas como se describe en el protocolo de texto para recoger un total de 900 microlitros de muestra. Centrifugar a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
A continuación, transfiera 270 microlitros del sobrenadante a cada uno de los tres nuevos tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Retire 40 microlitros del sobrenadante restante para ser utilizado como control de entrada, y transfiételo a un tubo nuevo. Coloque todas las muestras en hielo.
En primer lugar, etiquete cada uno de los tres tubos de muestra como se muestra aquí. Al tubo Kinase Reaction, añada 2,7 microlitros de CK2 y 2,7 microlitros de 2,5 mililitros de GTPgammaS. Deslice el tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo sobre hielo.
Para el tubo solo GTPgammaS, agregue 2,7 microlitros de 2,5 GTPgammaS mililolares y 2,7 microlitros de Lysis Buffer. Deslice este tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo en hielo. Al tubo PNBM Only añadir 5,4 microlitros de Lysis Buffer.
Deslice el tubo para mezclar e inmediatamente colóquelo sobre hielo. Incubar los tres tubos en un baño de agua a 30 grados centígrados durante un minuto. Después de esto, añadir 13,5 microlitros de PNBM a 12 miligramos por mililitro a cada tubo.
Invierta los tubos para mezclar las muestras e incubar las muestras a temperatura ambiente durante una hora. Mientras las muestras están incubando, etiquete cada una de las columnas para que la muestra se cargue, como se muestra aquí. Prepare las columnas invirtiendo cada columna varias veces para resuspender la resina Sephadex G-25 en el búfer de almacenamiento.
Fije cada columna a un soporte de abrazadera, y déjelo reposar durante aproximadamente cinco minutos para dejar que la resina se asiente. A continuación, coloque un tubo debajo de la abertura inferior de cada columna. Retire las tapas de la parte superior e inferior de cada columna, para permitir que el búfer de almacenamiento drene en los tubos por gravedad.
Una vez que el búfer de almacenamiento está agotado, agregue aproximadamente 2,7 mililitros de búfer de lysis a cada columna para equilibrarlos, asegurándose de recopilar y descartar el flujo a través. Repita este proceso de agregar el búfer de lysis y descartar el flujo a través de, tres veces. Para comenzar, cargue cada muestra en su columna respectiva.
Recoja y deseche el flujo a través. Agregue 420 microlitros de Lysis Buffer a cada columna para lavar las muestras. Deje que el búfer de lysis filtre a través de la columna y recopile y deseche el flujo.
A continuación, coloque los tubos en su posición debajo de cada columna para la recolección de muestras. Agregue 500 microlitros de Lysis Buffer a cada columna para eluir las muestras. Recoger el flujo a través, que ahora contiene una población enriquecida de tiofosforilados y alquilados sustratos de CK2 en la reacción de la quinasa.
La reacción de GTPgammaS sólo contendrá sustratos tiofosforilados y alquilados por cualquier CK2 endógeno presente. La reacción PNMB sólo contendrá proteínas alquiladas de fondo. Retire 80 microlitros de cada Elution como muestra de Control de entrada de elución.
A continuación, divida cada muestra en dos tubos que contengan cada uno 200 microlitros. Etiquete cada uno de los tubos para que sea éster anti tiofosfato o inmunoglobulina G, como se muestra aquí. Añadir 2,8 microgramos de anticuerpos anti-tiofosfato éster a cada uno de los tubos de éster anti-tiofosfato.
Añadir 2,8 microgramos de anticuerpos de control de isotipos a cada uno de los tubos IGG. A continuación, coloque los tubos en un rotador a cuatro grados Centígrados durante dos horas. Durante los últimos 15 minutos de la incubación de la muestra, utilice una cuchilla de afeitar limpia para cortar el extremo de una punta de pipeta P200 para aumentar el tamaño del medidor.
Inmediatamente antes de su uso, vórtice brevemente el tubo de almacenamiento que contiene las perlas de agarosa. Con la punta de la pipeta cortada, transfiera 100 microlitros de las perlas por inmunoprecipitación a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitros. Es importante vórtices las perlas antes de cada transferencia para evitar que las perlas se asienten.
Centrifugar los tubos a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire y deseche el sobrenadante. Resuspender las perlas mediante la adición de 200 microlitros de Lysis Buffer y brevemente vórtice para mezclar.
Repita este proceso de centrifugar y lavar las cuentas tres veces. Después del lavado final, coloque las cuentas sobre hielo hasta que estén listas para proceder. Cuando las muestras hayan terminado de incubar, centrifugarlas a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante tres minutos.
A continuación, transfiera 200 microlitros de cada muestra a los tubos que contienen las perlas lavadas. Coloque los tubos en un rotador a cuatro grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar los tubos a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto.
Retire 40 microlitros de cada sobrenadante para guardarlos como control de agotamiento. Retire y deseche el resto del sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar las cuentas. Lave las muestras añadiendo 200 microlitros de Lysis Buffer a cada uno y vórtices brevemente.
Centrífuga a 17.500 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante un minuto, descartando el sobrenadante. Repita este proceso de lavado y centrifugación tres veces teniendo cuidado de no molestar las cuentas. Después de esto, agregue 50 microlitros de tampón de muestra 2X a cada muestra que contenga perlas.
Para todas las demás muestras, que incluyen el control de entrada, los controles de entrada de elución y los controles de agotamiento, agregue 8 microlitros de búfer de muestra 6X. Pipetear cada tubo hacia arriba y hacia abajo para mezclar con la excepción de los tubos que contienen cuentas, y calentar todas las muestras a 95 grados Celsius durante cinco minutos antes de proceder con SDS-PAGE. Para evaluar si la inmunoprecipitación tuvo éxito, ejecute de 25 a 30 microlitros de cada muestra que se eludieron de las cuentas en un gel separado de poliacrilamida del 12,5%.
Mancha cada gel con Coomassie Blue para visualizar proteínas enriquecidas de varias etapas del protocolo experimental. Usando nuevas cuchillas de afeitar limpias, excúme cuidadosamente cualquier banda única presente en el éster anti tiofosfato de reacción quinasa IP Lane mientras toma nota de sus pesos moleculares aproximados. Se debe utilizar una nueva cuchilla de afeitar para cada banda única.
La base subyacente de esta técnica es que esta técnica es la capacidad inusual de CK2 de utilizar GTP para la transferencia de grupos de fósforo. La adición de la holoenzima exógena CK2 junto con el análogo GTP, GTPgammaS, a un lesado celular, da como resultado una tiofosforilación de sustratos endógenos de CK2. El tratamiento posterior del lisato con el reactivo alquilante p-Nitrobenzyl mesilato genera mitad ester de tiofosfato en estas proteínas de sustrato específicas, que luego pueden ser inmunoprecipitados utilizando un anticuerpo éster anti-tiofosfato y, en última instancia, identificado por espectrometría de masas.
En los resultados positivos representativos mostrados aquí, CK2 dependiente, tiophosforilación y posterior alquilación tuvieron éxito. Como era de esperar, una señal de éster anti-tiofosfato mejorada por hinchazón occidental se observa sólo en el carril que contiene la reacción quinasa completa, y no en el GTPgammaS solamente y PNMB sólo tratada muestras. Un gel teñido Coomassie Blue de las proteínas inmunoprecipitadas y aludidas, también demuestran un resultado positivo.
Como múltiples bandas únicas son evidentes sólo en el éster anti-tiofosfato IP Lane, en el que el izado fue incubado con exógeno CK2 y GTPgammaS. La banda marcada se extirpa del gel y se somete a identificación de proteínas por espectrometría de masas. Después de este procedimiento, los sustratos putativos CK2 identificados por una espectrometría de masas deben validarse mediante un enfoque adicional, como por la fosforilación dependiente de CK2 en un ensayo estándar de quinasa in vitro.
