التقرير الأساسي هو حقا تأكيد أهمية تحديد بدقة منطقة تردد محددة من غشاء basilar في معظم النماذج، حيث يمكن تحليل أرقام المشبك المتغيرة وظيفة. يتم تنفيذ توطين قوقعة مناطق التردد المحددة بشكل موثوق به باستخدام خرائط تردد موضع بالاقتران مع بيانات مخطط القوقعة. يوفر المجهر نظرة ثاقبة في العديد من الدراسات البحثية.
وهو يدعم فكرة أن الاعتلال العصبي القوقعة هو الأحداث الأولية الأولية التي تسبق على وجه التحديد فقدان السمع، وطنين الأذن، وفرط. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في تخدير ثمانية أسابيع البالغ البالغ C57 أسود 6J الماوس الذكور. ضع الماوس على وسادة حرارة 37 درجة مئوية في غرفة محمية كهربائيًا وصوتيًا.
بعد ذلك، ضع قطب تسجيل إبرة قياس 20 ملليمترًا من 20 ملليمترًا، مع عمق ثلاثة ملليمترات تحت الجلد في قمة الجمجمة. قطب كهربائي مرجعي في منطقة parotid ipsilateral، تحت بينية الأذن المقاسة وأقطاب أرضية في منطقة parotid contralateral. ضع مكبر صوت حقل مغلق مجهزًا بأنبوب بلاستيكي سنتيمترين مع طرف مخروط على شكل مخروط بجوار الماوس وتناسب الطرف في قناة الأذن الخارجية.
لاستجابة جذع الدماغ السمعية، أو تسجيل ABR، توليد نقاط لهجة في انخفاض مستويات ضغط الصوت من 90 إلى 10 ديسيبل، في خمس إلى 10 ديسيبل مستوى الضغط الصوتي الخطوات. أثناء هذه الخطوة، يتم تضخيم الاستجابات وتصفيتها ومتوسط. في كل تردد، حدد عتبة ABR، وهو مستوى ضغط الصوت الأدنى الذي ينتج عنه تسجيل ABR موثوق به مع واحدة أو أكثر من الموجات المميزة التي يمكن تحديدها بوضوح عن طريق الفحص البصري.
بعد تسجيل ABR ، فضح الثيران من الجانب البطني وفتح الثيران مع مقص حاد للوصول إلى قوقعة الأذن. باستخدام ملقط غرامة، وإزالة العظام الصدغية وقطع الشريان stapes. ثم إزالة ستابس من النافذة البيضاوية وتمزق غشاء النافذة المستديرة.
تدوير بلطف غيض من 13 ملليمتر 27 قياس إبرة لجعل ثقب صغير في قمة القوقعة، قبل استخدام ماصة يميل غرامة لتدفق بلطف 4٪ شبهformaldehyde من خلال النافذة في المساحات perilymphatic. بعد ذلك، شطف العظام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل مع 0.1 PBS المولية الباردة لكل غسل. متبوعاً بتجمّع العظام بنسبة 10٪ EDTA لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة و20 دوران في الدقيقة على شاكر أفقي.
في نهاية الحضانة، نقل العظام الصدغية decalcified إلى 0.1 مُضرس PBS جديدة تحت مجهر تشريح. استخدم 3 و5 ملقط Dumont وإبرة قياس 27 لتشريح مناطق قوقعة الأذن المتوسطة والوسطى والباسطية في المقابل. استخدم شفرة حلاقة لإجراء سلسلة صغيرة من التخفيضات على طول الرباط الحلزوني وإزالة الغشاء التكتوري وغشاء ريسنر.
مزيد من تشريح ظهارة السمع المتبقية، بما في ذلك أطرافه الحلزونية، في يتحول القوقعة الفردية للتحضيرات جبل كله. ثم استخدام الهدف 40X النفط من المجهر الخفيف لقياس طول غشاء باسيلار مع 250 مقياس ميكرومتر وضعت في قطعة العين. ويمكن تعديله على طول stereocilia من خلايا الشعر الداخلية.
بعد تشريح, وضع كل القوقعة تتحول إلى أنابيب جهاز طرد مركزي 2.5 ملليلتر الفردية. كتلة أي ربط غير محدد مع مصل الماعز 10٪ في برنامج تلفزيوني في 0.1٪ تريتون X-100 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على الدوار. في نهاية الحضانة، استخدم 200 طرف ماصة ميكروليت لإزالة الحل تحت مجهر تشريح.
احتضان العينات مع الأجسام المضادة الأولية من الفائدة المخففة في مصل الماعز 5٪ وبرنامج تلفزيوني في 0.1٪ تريتون X-100 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على الدوار. في صباح اليوم التالي، شطف عينات الأنسجة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع PBS 0.1 المولى البارد لكل غسل لإزالة أي الأجسام المضادة الأولية المتبقية. ثم تسمية العينات مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة المخففة في مصل الماعز 5٪ في PBS في 0.1٪ تريتون X-100 لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة على الدوار، محمية من الضوء.
في نهاية الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات مع 0.1 PBS الضروس كما أظهرت ونقل العينات إلى لوحات فردية 35 ملليمتر تحتوي على 0.1 PBS الضرس. وضع قطرة من DAPI تكمل المتوسطة تصاعد على الشريحة ونقل العينات من برنامج تلفزيوني إلى المتوسطة المتصاعدة. ضع حافة واحدة من زلة الغطاء على كل شريحة والإفراج عن السماح للزلات الغطاء تسقط بلطف.
ثم جفف الشرائح في مربع شريحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لتصوير العينات، استخدم مجهرًا مشتركًا مع الليزر المناسب وعدسة غمر الزيت عالية الدقة 63X للحصول على ثمانية أكوام ميكرومتر كونفوكل Z من كل منعطف قوقعة. بالنسبة بتعداد الـ puncta متشابك، قم بتعيين رصات Z بحجم الخطوة 0.3 ميكرومتر لتغطي طول خلايا الشعر الداخلية بالكامل، ويمكن تصوير تأمين كل الـ puncta متشابك ودمج الصور التي تحتوي على البونكتا في كومة Z للحصول على إسقاط الوصول إلى Z.
استيراد الصور المدمجة في برنامج معالجة الصور المناسب. قم بتقسيم إجمالي عدد التشابك في كل مكدس Z في مناطق تردد محددة على عدد خلايا الشعر الداخلية الإيجابية DAPI لحساب عدد ال puncta متشابك لكل خلية. في كل منطقة تردد محددة، متوسط كل من puncta متشابك في ثلاث صور من حقول مجهرية مختلفة، تحتوي على تسعة إلى 11 خلايا الشعر الداخلية.
لتصور أفضل للهندسة الهيكلية والتعريب متشابك، استخدم أداة فرشاة لتقييم بصريا بنية متشابك وتوزيع خلايا الشعر الداخلية الفردية. لتفقد التجاور بين شرائط presynaptic وبقع مستقبلات ما بعد المينابك ، استخدم أداة مستطيلة سرادق استخراج الفضاء voxel حول شرائط واستخدام قطع الصورة لعزل شرائط الفردية. ثم انقر فوق حجم الصورة والصورة للحصول على صفيف مصغر من هذه الإسقاطات المصغرة التي يمكن استخدامها لتحديد نقاط الاشتباك العصبي المقترنة مقابل شرائط معزولة.
عرضت كل عشرة من الفئران في هذه التجربة التمثيلية عتبات ABR استجابة لرشقات لهجة تتراوح بين 25 و 70 ديسيبل لكل مستوى ضغط الصوت اعتمادا على وتيرة التحفيز. وكانت عتبة السمع لهذه التجربة أدنى مستوى لها عند 16 كيلوهرتز مقابل 43٪ تقريباً من المسافة من قمة القوقعة، مما يشير إلى أن الحساسية الصوتية تنخفض بشكل كبير في مناطق القوقعة الأخرى. يتم تشريح يتصاعد كامل من ظهارة السمعية إلى ثلاث قطع ويتم قياس أطوال وتحويلها إلى المسافة في المئة من قمة القوقعة.
يتم حساب موقع التردد على الغشاء الباسيلاري لكل منعطف قوقعة باستخدام وظيفة لوغاريتمية. في الأذنين العاديتين للفئران البالغة ، يكشف الكبت المناعي عن أزواج متشابكة من الأشرطة المتشابكة وبقع مستقبلات الغلوتامات. دراسة سطح الغشاء القاعدي لخلايا الشعر الداخلية، مع 8 إلى 20 زوجاً في كل خلية.
على الرغم من أن الغالبية العظمى من البوتكتا تظهر كأزواج متجاورة في الأذنين العاديتين ، إلا أن الشرائط اليتيمة لا تُلاحظ بشكل متكرر عند التكبير العالي. عدد نقاط الاشتباك العصبي الداخلية خلية الشعر الشريط هو أعلى في منطقة 16 كيلوهيرتز وينخفض بشكل ملحوظ مع زيادة المسافة من هذا الموقع. أهم شيء يجب أن نتذكر خلال هذا الإجراء هو أن المرء يجب أن يضمن سلامة الغشاء القاعدي القوقعة.
نحن بحاجة إلى التأكيد على الدقة حتى يتم الوصول إلى الكفاءة التقنية. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء العلاج الجيني للإجابة على ما إذا كان يمكن إصلاح الاعتلال العصبي القوقعة من خلال هذا الإجراء. هذا التدبير هو تقنية أوسع لاستكشاف الاعتلال العصبي القوقعة, الذي إذا كانت الأحداث الأولية الأولية المنتسبين مع وجود فقدان السمع, طنين الأذن, وفرط.
